Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測,。對已知表達(dá)蛋白,，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物,，可通過融合部分的抗體檢測,。
本文主要通過以下幾個(gè)方面來詳細(xì)地介紹一下Western Blot技術(shù):
一、原理
二,、 分類
i.放射自顯影
ii.底物化學(xué)發(fā)光ECL
iii.底物熒光ECF
iv.底物DAB呈色
三,、 主要試劑
四、 主要步驟
五,、 實(shí)驗(yàn)常見的問題指南
1.參考書推薦
2.針對樣品的常見問題
3.抗體
4.濾紙,、膠和膜的問題
5.Marker的相關(guān)疑問
6.染色的選擇
7.參照的疑問
8.緩沖液配方的常見問題
9.條件的摸索
10.方法的介紹
11.結(jié)果分析

一、 原理
與Southern或Northern雜交方法類似,，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳,，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體,，“顯色”用標(biāo)記的二抗,。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上,，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì),，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng),，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng),，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá),。

二,、分類

現(xiàn)常用的有底物化學(xué)發(fā)光ECL和底物DAB呈色，體同水平和實(shí)驗(yàn)條件的是用第一種方法,，目前發(fā)表文章通常是用底物化學(xué)發(fā)光ECL,。只要買現(xiàn)成的試劑盒就行，操作也比較簡單,，原理如下（二抗用HRP標(biāo)記）：反應(yīng)底物為過氧化物+魯米諾,，如遇到HRP，即發(fā)光,，可使膠片曝光,，就可洗出條帶。

三,、主要試劑
1,、 丙烯酰胺和N，N’-亞甲雙丙烯酰胺,，應(yīng)以溫?zé)?以利于溶解雙丙稀酰胺)的去離子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,，N’-亞甲雙丙烯酰胺儲(chǔ)存液丙稀酰胺29g，N,，N-亞甲叉雙丙稀酰胺1g,，加H2O至100ml。)儲(chǔ)于棕色瓶,，4℃避光保存,。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的,。使用期不得超過兩個(gè)月,，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀,，可以過濾,。
2、 十二烷基硫酸鈉SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS,，1mlH2O去離子水配制,，室溫保存。
3,、 分離膠緩沖液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合,，加水稀釋到100ml終體積,。過濾后40C保存。