以獲得側鏈全保護的多肽為總目標, 選擇接入溴乙?；咽值腤ang樹脂作為固相載體, 采用多肽固相合成法制備了3種模型肽, 將其用于對具有弱堿性和強親核性的肟鹽類裂解劑的研究; 設計并制備了5種不同結構的肟銫鹽, 將其用于模型肽的裂解, 并選擇綜合效果最好的2-吡啶甲醛肟銫鹽進行裂解條件的優(yōu)化. 結果表明, 肟銫鹽類裂解劑可以溫和,、 高效地裂解模型肽, 得到側鏈全保護的多肽.

關鍵詞：側鏈全保護; 固相合成; 肟銫鹽; 裂解

生物活性肽是蛋白質中20種天然氨基酸以不同組成和排列方式構成的從二肽到復雜的線性、 環(huán)形結構的不同肽類的總稱, 在生活[1],、 醫(yī)療[2],、 健康[3]和食品[4]等方面占據不可取代的地位, 極具發(fā)展前景, 對其進行合成與生產具有重要意義. 目前, 生物活性肽的獲得主要有生物法提取[5]、 發(fā)酵[6]和化學法合成[7]. 無論是生物法還是化學法[8], 制備過程中都難以保持多肽活性, 其原因是某個氨基酸發(fā)生了消旋反應或者保護基意外脫除, 可能改變其二級結構從而破壞肽鏈的活性位點[9].

化學法合成多肽主要有溶液法和固相法, 與溶液法相比, 固相法合成多肽具有操作簡便, 產物便于分離純化等優(yōu)點, 尤其適合長鏈肽的合成. 由于生物活性肽大部分具有較長的肽鏈, 因此固相法合成生物活性肽是較好的選擇[10]. 但是一系列合成的條件, 如樹脂和連接把手的選擇,、 氨基酸的接入以及肽鏈的裂解等, 都需要根據活性肽的結構進行具體選擇[11], 以使其處于盡量溫和的制備環(huán)境.

選擇合適的固相載體是運用固相合成法快速,、 高效合成多肽的關鍵[12], 目前最常用的載體樹脂是Wang樹脂[13]. 將把手(Linker, 又稱連接臂, 連接橋)引入到載體上是聚合物載體應用于合成的前提條件, 也是選擇裂解試劑的重要依據. Fields等[14]對肽鏈的裂解試劑進行了深入研究, 為避免采用酸解、 堿解等能對肽鏈的側鏈保護基產生明顯影響的裂解方式, 親核裂解劑是較佳選擇, 它可以在較弱的堿性條件下對肽鏈進行親核進攻, 最終得到碳端游離的多肽.

肟的通式為R1R2C=NOH, C=N鍵的拉電子作用使肟基上的H具有一定的酸性, 被堿脫去即形成肟鹽, 因此肟鹽同時具有弱堿性和強親核性. 要奪取肟基上的H使其成為肟鹽需具有一定的堿性, 但堿性不宜太強. 銫是位于第六周期的堿金屬(ⅠA)族元素, 由于離子半徑較大, 銫與肟反應生成的肟銫鹽也較活潑, 即肟陰離子的親核性較強, 因此本文以肟銫鹽為研究對象.本文采用固相法合成了3種模型肽作為裂解對象, 制備了一系列肟銫鹽分別對模型肽進行裂解, 并對裂解產物進行鑒定, 還比較了裂解效率. 根據實驗結果遴選出1種綜合效果較好的肟銫鹽, 以此肟銫鹽為實驗對象, 探索了最優(yōu)裂解條件.

1.1.1 模型肽的合成 稱取Wang樹脂(3 g, 1.13 mmol/g)置于50 mL固相反應器中, 用40 mL二氯甲烷溶脹, 在搖床上振蕩3 h.抽濾除去溶劑, 用30 mL二氯甲烷和甲醇間隔洗滌樹脂各3次, 再用二氯甲烷洗滌2次.

將溶脹后的樹脂轉移至250 mL三口燒瓶中, 燒瓶放入冷阱中, 加入100 mL二氯甲烷, 三乙胺(4.2 g, 40.0 mmol)作為縛酸劑. 將溴乙酰溴(6.6 g, 32.0 mmol)用60 mL二氯甲烷稀釋后加至恒壓滴液漏斗中. 當含有樹脂的溶液溫度降至低于-16 ℃時, 向燒瓶中緩慢滴加溴乙酰溴/二氯甲烷溶液, 反應體系始終通氮氣保護. 滴加完畢, 室溫下繼續(xù)反應5 h, 將溶液全部轉移至固相反應器中, 抽濾除去溶劑, 依次用30 mL二氯甲烷和甲醇間隔洗滌樹脂各2次, 用30 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和甲醇間隔洗滌各2次, 再用二氯甲烷洗滌各2次. 置于干燥箱中常溫下真空干燥72 h, 得3.357 g淡黃色樹脂, 根據增重法計算得樹脂與把手的連接率為87.0%. 結構改造后的樹脂負載量也發(fā)生了變化, 理論估算樹脂的負載量為0.88 mmol/g. 負載量的計算公式如下:

采用Kaiser試劑檢測發(fā)現, 樹脂顏色不變. 用哌啶(體積分數20%)的DMF溶液脫除Fmoc保護基(15 mL×2, 10 min, 20 min), 抽濾后產品依次用DMF(15 mL×3), DCM(15 mL×3)和DMF(15 mL×3)洗滌. 再次用Kaiser試劑檢測, 發(fā)現樹脂顏色變藍, 證明第一個氨基酸已經偶聯(lián).

將1.28 g Fmoc-Phe-OH,、 1.36 g苯并三氮唑-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)和486 mg 1-羥基苯并三唑(HOBt)溶于15 mL DMF中, 加入1.14 mL N,N-二異丙基乙胺(DIEA)活化5 min. 將溶液加入固相反應器中, 在搖床上振蕩反應3 h, 除去溶劑. 偶聯(lián)完畢, 依次用DMF(15 mL×3), DCM(15 mL×3)和DMF(15 mL×3)洗滌樹脂. 用Kaiser試劑檢測反應完全, 脫除Fmoc保護基后用相同的方法偶聯(lián)Boc-Ala-OH, 將樹脂完全干燥后稱重為1.389 g, 由增重法計算模型肽P1的合成產率為80.9%. 模型肽P2和P3的合成方法同上, 由增重法計算P2和P3的產率分別為82.1%和78.8%.

1.1.2 肟的制備 參照文獻[15]方法制備: 將2-吡啶甲醛(3.211 g, 30 mmol)和鹽酸羥胺(3.129 g, 45 mmol)溶于60 mL水中, 加入乙酸鈉(3.690 g, 45 mmol), 室溫下攪拌反應1 h, 過濾, 濾餅用濾液洗滌2次. 濾液放入冰箱冷藏3 h后再次過濾, 將2次所得濾餅合并, 干燥得到2-吡啶甲醛肟2.928 g, 產率80.0%. m.p. 112.9～113.4 ℃(文獻值[16]: 114 ℃).

采用相同方法制得3-吡啶甲醛肟2.851 g, 產率77.9%, m.p. 147.9～148.8 ℃(文獻值[17]: 146～148 ℃); 制得4-吡啶甲醛肟2.712 g, 產率74.1%, m.p. 130.2～131.0 ℃(文獻值[18]: 130～133 ℃).

將對二甲氨基苯甲醛(4.470 g, 30 mmol)和鹽酸羥胺(3.129 g, 45 mmol)溶于60 mL乙醇水溶液(體積分數60%)中, 加入氫氧化鈉(1.92 g, 48 mmol), 加熱回流反應4 h, 冷卻, 有大量白色固體析出, 過濾, 濾餅用濾液洗滌2次, 干燥得3.764 g白色固體4-二甲氨基苯甲醛肟, 產率76.5%, m.p. 146.3～147.2 ℃(文獻值[19]: 145～147 ℃).

1.1.3 肟銫鹽的制備 將2-吡啶甲醛肟(2.085 g, 17.0 mmol)溶于30 mL甲醇中, 加入氫氧化銫一水合物(2.722 g, 16.2 mmol), 油浴加熱回流反應4 h, 冷卻后過濾, 濾餅用濾液洗滌2次, 干燥得黃色固體2-吡啶甲醛肟銫鹽3.810 g, 產率92.6%, 密封保存?zhèn)溆?

采用相同方法制得3-吡啶甲醛肟銫鹽5.969 g, 產率90.7%; 4-吡啶甲醛肟銫鹽5.873 g, 產率94.0%; 環(huán)己酮肟銫鹽2.111 g, 產率90.7%; 4-二甲氨基苯甲醛肟銫鹽5.408 g, 產率90.9%, 均密封保存?zhèn)溆?

1.1.4 肟銫鹽對模型肽的裂解 分別用2-吡啶甲醛肟銫鹽,、 3-吡啶甲醛肟銫鹽、 4-吡啶甲醛肟銫鹽,、 環(huán)己酮肟銫鹽和4-二甲氨基苯甲醛肟銫鹽對模型肽P1, P2和P3逐一進行裂解實驗.

取2-吡啶甲醛肟銫鹽(610 mg)溶于20 mL DMF中, 超聲溶解制成2-吡啶甲醛肟銫鹽的DMF飽和溶液(0.12 mol/L), 溶液的pH值約為9. 分別取5 mL該溶液, 依次加入裝有500 mg模型肽P1, P2和P3的3個圓底燒瓶中, 常溫攪拌反應12 h, 反應液分別抽濾至3個錐形瓶中, 用2 mL DMF洗滌樹脂, 再用5 mL水洗滌2次, 用檸檬酸水溶液(體積分數5%)調節(jié)pH≈6, 溶液的黃色變淺, 靜置10 min后轉移至分液漏斗中, 用乙酸乙酯萃取3次, 合并乙酸乙酯層, 再用飽和食鹽水洗滌3次, 無水硫酸鈉干燥過夜. 濾掉干燥劑, 減壓蒸干溶液, 得到粗產品, 經柱分離[濕法裝柱, 濕法上樣, V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶1]得到游離的3種模型肽. 其余4種肟銫鹽裂解模型肽的實驗步驟同上.

1.1.5 裂解條件的優(yōu)化 配制2-吡啶甲醛肟銫鹽的飽和DMF溶液25 mL, 濃度為0.12 mol/L, 分別取5 mL該溶液加入5個裝有500 mg模型肽P1的小圓底燒瓶中, 常溫下攪拌反應, 反應時間分別為4, 6, 8, 10和12 h. 裂解液的后處理方式同1.2.4節(jié), 得到游離的模型肽.

分別稱取12, 24, 37, 49, 61和73 mg的2-吡啶甲醛肟銫鹽溶于5 mL DMF中, 所得溶液的濃度分別為0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.10和0.12 mol/L. 將不同濃度的裂解液分別加入裝有500 mg模型肽P1的圓底燒瓶中, 常溫下攪拌反應6 h, 裂解液的后處理同1.2.4節(jié).

2.1 模型肽的設計

由于氨基酸常用的側鏈保護基均對弱酸較敏感, 為了獲得側鏈全保護的多肽, 基于正交保護的原則, 選擇Wang樹脂和Fmoc/tBu保護的策略進行固相合成[20]. 綜合考慮實驗效果,、 側鏈保護情況和產物穩(wěn)定性等因素, 設計合成了3種模型肽序列.

模型肽P1: Boc-Ala-Phe-Leu-O-Linker. P1無側鏈保護基, 可驗證肟鹽能否將肽鏈從樹脂上裂解下來. 因其結構簡單, 可用于對肟鹽裂解最優(yōu)條件的探索實驗.模型肽P2: Boc-Ser(Bzl)-Leu-Ser(tBu)-O-Linker. P2只有兩端的氨基酸有側鏈保護基, 由于多肽兩端的氨基酸更容易受到裂解試劑的影響, 因此該三肽可用于探索肟鹽對側鏈保護基的影響.

模型肽P3: Boc-Ser(Bzl)-Asp(OtBu)-Lys(Z)-O-Linker. P3的3個氨基酸都帶有側鏈保護基, 特別是天冬氨酸的側鏈是叔丁酯保護, 對其進行裂解實驗可以判斷以肟鹽為裂解試劑時, 側鏈酯基能否經得住其堿性的影響, 從而得到側鏈全保護的多肽.

2.2 樹脂把手對裂解的必要性驗證和裂解機理

所設計的3種模型肽都是以結構改造后的Wang樹脂為固相載體進行合成的, 為探索此連接把手對肟銫鹽裂解效果的影響, 另外合成了模型肽P2x. P2x的肽序列與P2完全相同, 但它是以未連接把手的Wang樹脂為載體的3肽, 其序列為Boc-Ala-Phe-Leu-O-Wang. P2x的第一個氨基酸在4-二甲氨基吡啶(DMAP)的催化下通過縮合劑固定到樹脂上, 其它合成步驟與P2相同.

為驗證模型肽P2x的結構正確, 用10 mL三氟乙酸與二氯甲烷的混合溶液(體積比9∶1)裂解P2x 6 h后, 將裂解液過濾至25 mL圓底燒瓶中, 用氮氣吹干溶劑, 剩余1/10體積溶液時, 將殘液用膠頭滴管移至離心管中, 加入約5.0 mL無水乙醚, 出現白色絮狀沉淀, 以5000 r/min轉速離心10 min, 倒去上層清液, 重復2次, 除去大部分的雜質. 倒掉乙醚, 沉淀用少量去離子水溶解完全, 于冰箱中冷凍5 h, 在冷凍干燥機中真空干燥10 h, 得到白色固體. MS(C12H23N3O6計算值), m/z: 306.1656(306.1587)[M+H]+, 為目標產物(其質譜信息見本文支持信息圖S1).

用5 mL 2-吡啶甲醛肟銫鹽的DMF溶液(0.12 mol/L)對模型肽P2x裂解12 h, 后處理方法同1.2.4節(jié), 所得固體經HPLC-MS分析(見本文支持信息圖S2)無目標產物峰, 只有裂解劑經后處理生成的2-吡啶甲醛肟. MS(C6H6N2O計算值), m/z: 123.0726(123.0480)[M+H]+.

對比實驗結果表明, 以結構改造的Wang樹脂為載體合成的多肽可被2-吡啶甲醛肟銫鹽從樹脂上裂解下來; 而在相同條件下, 以未接入把手的Wang樹脂為載體合成的相同肽鏈則無法被2-吡啶甲醛肟銫鹽從樹脂上裂解下來. 這證明了把手的接入對肟鹽裂解效果的必要性, 若要肟鹽成功將肽鏈裂解, 該溴乙酰基把手是不可或缺的.

結構改造后Wang樹脂連接的溴乙?；咽质请夸C鹽親核進攻的作用位點. 因此, 推測2-吡啶甲醛肟銫鹽對結構改造后肽樹脂的裂解作用機理如Scheme 1所示.

采用質譜檢測了5種肟銫鹽對3種模型肽的裂解產物, 結果表明都得到了側鏈全保護的模型肽, 以2-吡啶甲醛肟銫鹽裂解P1, P2和P3的產物質譜圖(見本文支持信息圖S3～圖S5)為例進行譜圖解析, 結果如表1所示.

對于肽的裂解實驗, 裂解時間和裂解濃度是可控變量, 選擇這2個因素進行了最優(yōu)裂解條件的探索. 由表2可知, 3-吡啶甲醛肟銫鹽和2-吡啶甲醛肟銫鹽的裂解產率最高, 但實驗中發(fā)現3-吡啶甲醛肟銫鹽在空氣中放置一段時間容易變質發(fā)紅, 因此2-吡啶甲醛肟銫鹽是裂解效率較高且性質較穩(wěn)定的最優(yōu)裂解劑. 將其作為研究對象, 并選擇模型肽P1為裂解對象, 進行了裂解條件的優(yōu)化.

不同裂解時間和不同裂解濃度下的產率分別如表3和表4所示.

綜上, 最優(yōu)裂解條件是采用2-吡啶甲醛肟銫鹽的DMF溶液(0.12 mol/L), 在常溫下裂解6 h, 最優(yōu)裂解產率為78.8%.

2.5 影響裂解性能的因素

由于肟鹽對結構改造后Wang樹脂的裂解方式為親核裂解, 因此影響其裂解性能的主要因素為肟陰離子的親核性, 肟鹽的溶解度對其裂解效果也有一定影響. 本文分別從親核性和溶解度兩個方面對肟鹽的裂解性能進行分析討論.

肟鹽裂解劑的有效部分是肟成鹽后形成的肟陰離子, 因此只需比較幾種肟鹽中肟陰離子的親核性大小. 影響親核性的3個因素是電子云密度,、 空間位阻和溶劑化效應. 實驗所用5種肟鹽的結構基本相同, 空間位阻的影響可以忽略, 且均用非質子性溶劑DMF配制裂解液, 不存在溶劑化效應. 因此, 比較其親核性的大小可簡化為比較肟陰離子上電子云密度的大小.

2.5.1 芳香性對親核性的影響 在對二甲氨基苯甲醛肟銫鹽中, 苯環(huán)上的6個碳原子形成1個大π鍵, 碳-氮雙鍵也參與π共軛, 形成1個大的“π-π”共軛體系, 氮原子上連接的氧負離子由于“p-π”共軛的吸電子效應, 所帶負電荷有所減少, 電子云密度降低.但在苯環(huán)的對位上有1個取代基, 且二甲氨基是1個供電子基團, 氮原子上的孤對電子可以適當增加大π鍵共軛體系的整體電子云密度, 部分抵消對氧負離子電子云密度的削弱效應.

3種吡啶甲醛肟銫鹽中, 氮原子和5個碳原子形成1個大π鍵, 同樣, 碳-氮雙鍵與之形成1個大的“π-π”共軛體系, 使氧負離子因“p-π”共軛的吸電子效應而電子云密度降低. 但是氮原子的吸電子效應致使六元環(huán)變成了1個缺π雜環(huán), 即每個碳原子上的電子云密度都比苯環(huán)上的碳原子電子云密度低, 這對氧負離子的電子云密度又有一定的削弱作用. 因此, 3種類型的肟銫鹽親核性大小依次為環(huán)己酮肟銫鹽>對二甲氨基苯甲醛肟銫鹽>吡啶甲醛肟銫鹽.

2.5.2 取代基位置對親核性的影響 實驗結果表明, 3種吡啶甲醛肟銫鹽的裂解效果也不完全相同, 說明取代基所在位置對肟銫鹽的親核性也有影響. 在吡啶環(huán)上, 吸電子作用導致氮原子的鄰位和對位碳原子的電子云密度較低, 對于間位, 由于間位效應使得其電子云密度不至于過低, 分子的共振式也可以說明這一點.

綜上, 從親核性考慮, 肟銫鹽的裂解性能優(yōu)劣順序為環(huán)己酮肟銫鹽>對二甲氨基苯甲醛肟銫鹽>3-吡啶甲醛肟銫鹽>4-吡啶甲醛肟銫鹽>2-吡啶甲醛肟銫鹽.

比較實驗數據發(fā)現, 5種肟銫鹽的裂解效率高低不完全與親核性大小相符, 這說明溶解度的影響不可忽略, 通過實驗測得2-吡啶甲醛肟銫鹽,、 3-吡啶甲醛肟銫鹽、 4-吡啶甲醛肟銫鹽,、 環(huán)己酮肟銫鹽和對二甲氨基苯甲醛肟銫鹽在溶劑DMF的飽和濃度分別為0.12, 0.10, 0.11, 0.05和0.09 mol/L. 從溶解度可知, 肟銫鹽的裂解產率高低順序為2-吡啶甲醛肟銫鹽>4-吡啶甲醛肟銫鹽>3-吡啶甲醛肟銫鹽>4-二甲氨基苯甲醛肟銫鹽>環(huán)己酮肟銫鹽.

由表2可知, 5種肟銫鹽實際裂解產率大小順序為3-吡啶甲醛肟銫鹽>2-吡啶甲醛肟銫鹽>4-吡啶甲醛肟銫鹽>4-二甲氨基苯甲醛肟銫鹽>環(huán)己酮肟銫鹽. 實驗結果雖然不符合單獨考慮2種因素的任何一種結果, 但卻是2種因素共同作用的結果.

通過對2-吡啶甲醛肟銫鹽,、 3-吡啶甲醛肟銫鹽、 4-吡啶甲醛肟銫鹽,、 環(huán)己酮肟銫鹽和4-二甲氨基苯甲醛肟銫鹽的裂解性能進行研究發(fā)現, 5種肟銫鹽均能將肽鏈從固相載體上裂解下來, 得到側鏈全保護的多肽, 并且具有較好的裂解效率, 達到了溫和條件下裂解劑的要求. 對2-吡啶甲醛肟銫鹽裂解模型肽P1的條件進行了優(yōu)化, 結果表明, 在濃度為0.12 mol/L條件下裂解6 h可以達到最優(yōu)裂解產率78.8%. 肟銫鹽比肟鉀鹽的溶解度更好, 裂解產率更高, 這與理論推測一致, 且實驗過程中不需要用到高毒性的18-冠-6醚, 因此是對已有肟類裂解劑的一大改進.

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