由半胱氨酸構(gòu)建的二硫鍵在多肽藥物中是一類關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)元素,。在合成含有半胱氨酸的多肽藥物時(shí)，半胱氨酸的巰基必須要被保護(hù)基保護(hù)起來,，否則,，具有親核性的巰基會(huì)發(fā)生許多副反應(yīng)。本文介紹了半胱氨酸各種類型的保護(hù)基及其相應(yīng)的脫除條件,。

關(guān)鍵詞：半胱氨酸 ,； 保護(hù)基 ； 二硫鍵

多肽是一類普遍存在于生物體內(nèi)由氨基酸通過肽鍵連接組成的化學(xué)物質(zhì),，迄今在生物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多達(dá)數(shù)萬種的多肽分子,。由于其具有獨(dú)特的生物活性，多肽在治療癌癥等疑難病上起到良好的效果,，因此,，近年來吸引了越來越多的制藥企業(yè)投入到多肽藥物的研究和開發(fā)中。

分子骨架中有一對(duì)或多對(duì)由半胱氨酸構(gòu)建的二硫鍵的多肽分子是多肽類藥物中一類具有更加獨(dú)特生物活性的分子,。在合成含有半胱氨酸的多肽藥物時(shí),，側(cè)鏈含有的半胱氨酸是必須要被保護(hù)基保護(hù)的，否則其含有的具有高親核性的巰基將有可能發(fā)生?；?、烷基化或者被空氣氧化形成二硫鍵等副反應(yīng) [1]。

由半胱氨酸構(gòu)建的二硫鍵這一關(guān)鍵結(jié)構(gòu)存在于許多具有潛在藥理活性的多肽藥物中,，為了使這些潛在藥物真正被應(yīng)用到實(shí)際治療疾病過程中或者臨床前期的評(píng)估中,，目前大量的研究和優(yōu)化工作已經(jīng)開展 [2]。

然而對(duì)于肽鏈中含有多個(gè)半胱氨酸的多肽藥物,，在構(gòu)建多個(gè)二硫鍵時(shí)將會(huì)遇到一個(gè)困難,，即如何能保證做到按照分子設(shè)計(jì)的那樣清晰明了地構(gòu)建相應(yīng)的二硫鍵。為了解決這個(gè)問題,，就需要在肽鏈合成中選擇合適的保護(hù)基對(duì)不同位點(diǎn)的半胱氨酸進(jìn)行正交保護(hù),，從而實(shí)現(xiàn)逐步合成理想的多個(gè)二硫鍵的多肽藥物 [3]。

1.1　酸敏感保護(hù)基

1.1.1　芐基及其取代芐基類

芐基及其取代芐基類衍生物是一類對(duì)酸敏感的半胱氨酸保護(hù)基,，主要應(yīng)用在Boc/Bn固相合成策略中,。隨著芳環(huán)上取代基的不同，芐基類保護(hù)基對(duì)酸的敏感程度和脫除的難易也有比較大的區(qū)別,。

芐基(Bn)的脫除需要比較苛刻的實(shí)驗(yàn)條件(HF,、25 ℃或者鈉在液體氨水中 [4])才能實(shí)現(xiàn)；對(duì)甲基芐基(Meb)對(duì)酸相對(duì)比較敏感,，脫除條件相對(duì)于芐基就比較溫和一點(diǎn),，只需要HF和捕獲劑在低溫下就可以實(shí)現(xiàn)脫除,；而對(duì)甲氧基芐基(Mob)是一種比Meb對(duì)酸更加敏感的保護(hù)基，脫除它只需要HF和捕獲劑在零度條件下就可實(shí)現(xiàn),，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)Mob作為保護(hù)基的粗肽純度比用Meb作保護(hù)基的高 [5],。

三甲氧基芐基(Tmob)也是一種對(duì)酸敏感的芐基類衍生物，但這個(gè)保護(hù)基主要應(yīng)用于Fmoc/ tBu的固相合成策略,。脫除這個(gè)保護(hù)基只需要在稀的TFA和捕獲劑存在下就可以實(shí)現(xiàn),。然而值得注意的是脫除下來的三甲氧基芐基陽離子會(huì)與色氨酸(Trp)發(fā)生烷基化的副反應(yīng) [6]。

由此可知,，芐基及其衍生物對(duì)酸敏感度的相對(duì)關(guān)系：Mob > Meb > Bn,，此類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)見圖1。

1.1.2　二苯甲基和三苯甲基類

三苯甲基類的半胱氨酸保護(hù)基是一類在Fmoc/ tBu固相合成策略中比較經(jīng)典和常用的保護(hù)基,。三苯甲基(Trt)可以用TFA(>25%濃度)和捕獲劑(例如三異丙基硅烷 TIS,，為了阻止脫下來的三苯甲基陽離子再次與巰基反應(yīng))脫除 [7]。而單甲氧基三苯基(Mmt)與Trt相比是一類對(duì)酸更加敏感的保護(hù)基,，脫除Mmt保護(hù)基只需要在很稀的TFA(1%~5%濃度)和捕獲劑存在下就可實(shí)現(xiàn) [8],。另外，無論是Trt還是Mmt都可以在碘作用下一步實(shí)現(xiàn)脫除和氧化形成二硫鍵,。

然而在一些實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),，當(dāng)Trt和Mmt被用作正交半胱氨酸保護(hù)基時(shí)，用1%的TFA脫除Mmt時(shí)并不能徹底脫除,，而正交的Trt保護(hù)基卻發(fā)現(xiàn)被部分脫除,，這種現(xiàn)象就導(dǎo)致最終不能得到較好的產(chǎn)品純度和收率。因此,，近年又發(fā)展了一種二苯甲基的保護(hù)基(Dpm),，脫除此保護(hù)基需要比較高濃度的TFA(> 60%)才能實(shí)現(xiàn) [9]。這樣當(dāng)Dpm與Trt或者M(jìn)mt同時(shí)使用時(shí),，就能起到很好的正交結(jié)果,。此類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)如圖2所示。

1.1.3　叔丁基類

叔丁基( tBu)和含有叔丁基骨架的半胱氨酸保護(hù)基(1-Ada)(如圖3所示)在TFA條件下非常穩(wěn)定,，因此此類保護(hù)基主要應(yīng)用與Boc/Bn固相合成策略中 [10],。脫除這類保護(hù)基需要用HF在相對(duì)高溫和捕獲劑條件下才能實(shí)現(xiàn),。

1.2　堿敏感保護(hù)基

堿敏感的半胱氨酸保護(hù)基主要有芴甲基(Fm),、2，4-二硝基-苯乙基(Dnpe),、芴甲氧羰基(Fmoc),、烯丙氧氣羰基(Alloc)這幾種(如圖4所示)，這些保護(hù)基只適合用于Boc/Bn固相合成策略中,。

芴甲基(Fm)的脫除需要在50% piperidine/DMF中反應(yīng)2 h,，而如果用10% piperidine/DMF則需要反應(yīng)過夜才能保證徹底脫除,。此保護(hù)基對(duì)強(qiáng)酸有比較好的耐受性，即使在HF下也比較穩(wěn)定 [11],。

Dnpe的脫除在50% piperidine/DMF中只需要30~60 min,，值得強(qiáng)調(diào)的是在此條件下保護(hù)基被脫除的同時(shí)二硫鍵也隨之形成。如果想得到含有自由巰基的產(chǎn)物,，就需要在脫除劑中加入額外的自由巰基分子如2-巰基乙醇 [12],。

Fmoc保護(hù)基的脫除需要用三乙胺在碘作用下同時(shí)實(shí)現(xiàn)脫除和形成相應(yīng)的二硫鍵，而且這種脫除方法并不會(huì)影響氨基的Fmoc保護(hù)基 [13],。

Alloc保護(hù)基的脫除要用到金屬催化劑Pb(0)在Bu 3SnH存在下,，常用的金屬催化劑是Pd(PPh 3) 4 [14]。

1.3　酸,、堿相對(duì)穩(wěn)定的保護(hù)基

酸,、堿相對(duì)穩(wěn)定的保護(hù)基主要有乙酰氨甲基(Acm)、苯乙酰氨甲基(Phacm),、叔丁基硫基(S tBu)三種(如圖5所示),，由于此類保護(hù)基對(duì)酸、堿的耐受性相對(duì)都比較好,，因此既可以應(yīng)用在Boc/Bn固相合成策略中也可以應(yīng)用在Fmoc/ tBu固相合成策略中,。

Acm保護(hù)基可以在碘或者鉈鹽 [15]的作用下一步實(shí)現(xiàn)脫除和二硫鍵的形成，用汞鹽或者銀鹽處理Acm保護(hù)基時(shí)可以得到含有自由巰基的產(chǎn)物,。此外,，也發(fā)現(xiàn)Acm保護(hù)基在HF條件下可以被部分脫除 [16]。

Phacm與Acm的化學(xué)性質(zhì)非常相似,，脫除Acm的條件同時(shí)也可以應(yīng)用到此保護(hù)基中,。另外，Phacm具有一個(gè)獨(dú)特的性質(zhì),，即可以被青霉素水解酶在非常溫和條件下脫除 [16],。

S tBu保護(hù)基的脫除需要用到額外的巰基，如苯硫酚,、2-巰基乙醇,、二硫蘇糖醇等。此保護(hù)基也可以被HF部分脫除 [18],。

1.4　光敏感保護(hù)基

光敏感半胱氨酸保護(hù)基發(fā)現(xiàn)和發(fā)展的一個(gè)主要原因，就是為了克服在苛刻條件下脫除半胱氨酸保護(hù)基時(shí)引起其它敏感基團(tuán)發(fā)生副反應(yīng)的可能性,。因?yàn)楣饷舾斜Ｗo(hù)基的脫除條件非常的溫和,，只需要在溶液中光照( λ= 300~ 400 nm)條件下就可實(shí)現(xiàn)脫除，而不需要再額外添加任何試劑，這樣就最大程度地減少了其它敏感基團(tuán)副反應(yīng)發(fā)生的可能性,。

目前常用的光敏感保護(hù)基主要有2-硝基-苯甲基(oNb)和2-硝基-4,，5-二甲氧基-苯甲基(oNv)(如圖6所示)這兩種，此類保護(hù)基可應(yīng)用與Boc/Bn和Fmoc/ tBu兩種固相合成策略中,。另外,，相對(duì)于oNb，oNv由于在350 nm處有比較強(qiáng)的吸收,，因此oNv光敏感保護(hù)基在實(shí)際應(yīng)用中更受歡迎,。

1.5　保護(hù)與活化功能兼具的保護(hù)基

在構(gòu)建二硫鍵的時(shí)候此類保護(hù)基不僅起到保護(hù)半胱氨酸巰基的功能同時(shí)也具有活化巰基的特性。這樣的保護(hù)基以Npys18和S-Pyr19類為主(如圖7所示),，此類保護(hù)基由于對(duì)堿相對(duì)敏感,，因此主要應(yīng)用在Boc/Bn固相合成策略中。如果此類保護(hù)基是在肽鏈的N端時(shí),，也可以應(yīng)用在Fmoc/ tBu固相合成策略中,。脫除這類保護(hù)基需要引入額外的自由巰基，因此如果肽鏈中含有二硫鍵的話可能存在二硫鍵被巰基斷開的風(fēng)險(xiǎn),。

2　結(jié)論與展望

采用化學(xué)方法合成多肽類物質(zhì)在生物化學(xué)中是一種非常重要的工具,。然而開發(fā)更加有效的方法來構(gòu)建復(fù)雜多肽分子依舊存在巨大的挑戰(zhàn)，其中一個(gè)挑戰(zhàn)就是如何準(zhǔn)確地構(gòu)建含有多個(gè)由半胱氨酸形成的二硫鍵的多肽分子,，因?yàn)樵诤铣纱祟惗嚯姆肿又?，?jīng)常會(huì)遇到不能按照分子設(shè)計(jì)的那樣準(zhǔn)確地構(gòu)建設(shè)定的二硫鍵分子，總是會(huì)有二硫鍵混雜現(xiàn)象的發(fā)生,。而為了避免和解決這個(gè)問題,，就需要在多肽合成中選用合適的保護(hù)基來進(jìn)行正交保護(hù)半胱氨酸。

隨著新多肽藥物的發(fā)現(xiàn)和多肽技術(shù)的不斷更新,，特別是在構(gòu)建含有多個(gè)二硫鍵的多肽藥物時(shí),，對(duì)半胱氨酸保護(hù)基的正交選擇尤為重要。盡管目前半胱氨酸的保護(hù)基種類很多,，但是發(fā)現(xiàn)和發(fā)展更加有效的以及脫除條件更加溫和的新的保護(hù)基始終是多肽藥物合成研究的重點(diǎn),。

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