為合成靶向碳酸酐酶IX(CA IX)的多肽探針68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10,建立68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記及質(zhì)控方法,對(duì)pH和前體多肽DOTA-CA IX-P1-4-10濃度對(duì)標(biāo)記率的影響進(jìn)行研究,確定68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記條件為:反應(yīng)體系的pH為4.0～5.0(n=6),多肽DOTA-CAIX-P1-4-10濃度為15.0～40.0 mg/L(n=6),反應(yīng)溫度為100 ℃,反應(yīng)時(shí)間10 min。產(chǎn)品為無色澄明液體,、無可見異物,pH為5～7(n=6),放化純度>99.0%(n=6),比活度為1.0～5.0 GBq/μmol(合成結(jié)束后)(n=6),。探針的脂水分配系數(shù)為-2.07±0.01(n=6),具有良好的親水性,。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10在生理鹽水和胎牛血清中孵育4 h,放化純度>95.0%,具有良好的體外穩(wěn)定性,。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10無異常毒性。初步評(píng)價(jià)結(jié)果表明,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10標(biāo)記方法簡單,、放化純度高,、性質(zhì)穩(wěn)定、無異常毒性,具有開展進(jìn)一步研究的價(jià)值,。

關(guān)鍵詞：68Ga-標(biāo)記;多肽;碳酸酐酶 IX(CA IX)

碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX, CA IX)是一種與腫瘤相關(guān)的跨膜金屬酶[1],。CA IX通過調(diào)節(jié)CO2和H2O生成碳酸氫鹽與質(zhì)子的可逆反應(yīng)降低腫瘤細(xì)胞外環(huán)境的pH,腫瘤細(xì)胞黏附力也隨之降低,該現(xiàn)象促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[2],。除胃腸黏膜組織外,正常組織中幾乎沒有CA IX的表達(dá)[3]。CA IX在多種實(shí)體瘤中過表達(dá),如腎癌,、宮頸癌,、頭頸部癌、乳腺癌和肺癌等[4],因此CA IX是腫瘤診斷的理想靶點(diǎn),。

近年來,以CA IX為靶點(diǎn)的小分子,、抗體和多肽類放射性分子影像探針均被廣泛報(bào)道[5-6]。小分子抑制劑類探針有著較高的結(jié)合親和力和較短的血液半衰期,使其成為開發(fā)靶向CA IX探針時(shí)有吸引力的候選藥物[4],。但由于碳酸酐酶亞型之間的高度同源性,小分子抑制劑類探針開發(fā)時(shí)面臨著靶向特異性的重要挑戰(zhàn)[7],。目前小分子探針18F-VM4-037已經(jīng)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn),然而更多研究顯示該探針的腫瘤攝取與背景組織相當(dāng)[8]。Lau等[9]合成了小分子探針18F-AmBF3-ABS,通過PET/CT顯像實(shí)現(xiàn)了HT29腫瘤的可視化,但圖像顯示靶/非靶比值較低,。抗體類探針具有優(yōu)異的靶向特異性,且在非靶組織中呈現(xiàn)低攝取,已被廣泛應(yīng)用于成像領(lǐng)域,。多種靶向CA IX的抗體探針已進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)階段,如124I-girentuximab的PET/CT顯像可以準(zhǔn)確無創(chuàng)地識(shí)別腎透明細(xì)胞癌的病灶,可為腎癌患者制定診療計(jì)劃提供幫助[10]。但由于抗體類探針分子量較大,腫瘤穿透能力相對(duì)較差且血液清除緩慢,導(dǎo)致早期顯像的靶/非靶比值低,以及體內(nèi)代謝時(shí)間長引起的高輻射毒性[11],。

多肽類探針分子量適中,靶向性良好,并能實(shí)現(xiàn)在血液中快速清除,具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì),因此放射性標(biāo)記肽在核醫(yī)學(xué)影像中越來越受到關(guān)注[12],但靶向CA IX多肽類探針的報(bào)道較少。課題組曾利用點(diǎn)擊化學(xué)方法制備放射性標(biāo)記肽18F-CA IX-P1-4-10[13],micro PET/CT顯像結(jié)果顯示,探針可以特異性的識(shí)別腫瘤中CA IX陽性區(qū)域,但腹部器官對(duì)該探針具有較高的攝取,不利于腹部轉(zhuǎn)移灶的診斷,這可能是該探針穩(wěn)定性差導(dǎo)致,。

本研究針對(duì)多肽探針18F-CA IX-P1-4-10體內(nèi)外穩(wěn)定性差的問題,對(duì)多肽結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)一步的優(yōu)化和修飾,并利用正電子核素68Ga進(jìn)行標(biāo)記,。對(duì)68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的制備方法、質(zhì)量控制和體外穩(wěn)定性進(jìn)行初步研究,以期獲得一種多肽類的CA IX靶向放射性分子影像探針,。

1.1 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的放射化學(xué)合成

將前體多肽DOTA-CA IX-P1-4-10溶于生理鹽水,制成濃度為1 mg/mL的溶液備用,。用5 mL 0.1 mol/L HCl淋洗68Ge/68Ga發(fā)生器,收集68Ga3+的淋洗液以備標(biāo)記使用。

68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的合成方法示于圖1,。在68Ga-HCl淋洗液中,加入多肽DOTA-CA IX-P1-4-10溶液,然后用1 mol/L乙酸鈉溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH,加熱振蕩反應(yīng),。反應(yīng)結(jié)束后冷卻,反應(yīng)溶液通過Light C18柱,用10 mL超純水洗去雜質(zhì)和鹽分,用1 mL體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇淋洗Light C18柱,收集產(chǎn)品并用生理鹽水稀釋,通過0.22 μm一次性無菌濾器過濾后備用。

1.2 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的質(zhì)量控制

取產(chǎn)品適量,目視觀察產(chǎn)品的顏色,、澄清度,在澄明度儀下檢測產(chǎn)品的可見異物;利用廣泛pH試紙測定產(chǎn)品的pH;采用Radio-TLC和Radio-HPLC法對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行鑒別并測定探針的放射化學(xué)純度;采用Radio-HPLC法測定產(chǎn)品的比活度,。本研究中比活度的計(jì)算方法為:探針比活度=探針的活度/活性分子的物質(zhì)的量(GBq/μmol)。

Radio-TLC分析方法如下:以體積比為1∶1的甲醇和水溶液配制的1 mol/L的乙酸銨溶液作為展開劑,以ITLC-SG色譜紙為固定相,展開距離為6 cm,。Radio-HPLC分析方法如下:流動(dòng)相A為H2O(0.1% TFA),B為乙腈,。采用等梯度洗脫:0～10 min,18% B,流速為1 mL/min,紫外檢測波長為220 nm,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫25 ℃。

1.3 脂水分配系數(shù)(Log P)

將500 μL純化后的68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10(3.7 MBq)產(chǎn)品加入到等體積的正辛醇中,混合物在室溫下充分混勻,經(jīng)離心后靜置分層,。從水相和有機(jī)相各取樣100 μL分別置于γ計(jì)數(shù)管中,用γ計(jì)數(shù)器測定放射性計(jì)數(shù),。共進(jìn)行六組平行實(shí)驗(yàn),采用下面公式計(jì)算Log P=log(γ正辛醇 /γ生理鹽水)。其中γ正辛醇為正辛醇層取樣中的γ計(jì)數(shù),γ生理鹽水為生理鹽水層取樣中的γ計(jì)數(shù),。

1.4 體外穩(wěn)定性

將500 μL探針68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10(約14.8 MBq)溶液,分別加入1 mL生理鹽水和1 mL胎牛血清中,37 ℃下孵育,分別在0.5,、1、2,、3,、4 h取樣,采用Radio-TLC檢測其放化純度,以評(píng)價(jià)其體外穩(wěn)定性,。

1.5 異常毒性

取正常小鼠(ICR小鼠,雄性,江蘇華創(chuàng)信諾醫(yī)藥科技有限公司),體重20.0～22.0 g(n=5),每只小鼠在5 s內(nèi)經(jīng)靜脈注射500 μL 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10(37 MBq)產(chǎn)品溶液,給藥后飼養(yǎng)觀察48 h,考察小鼠的存活情況。

2.1 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的放射化學(xué)合成

2.1.1 pH的選擇 在前體濃度為75 mg/L,、反應(yīng)溫度為100 ℃,、反應(yīng)時(shí)間10 min時(shí),考察反應(yīng)體系的pH對(duì)標(biāo)記反應(yīng)的影響,標(biāo)記率隨pH的變化規(guī)律示于圖2。當(dāng)反應(yīng)體系的pH在4.0～5.0之間時(shí),68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記率均>95.0%,當(dāng)反應(yīng)體系的pH為4.5時(shí),標(biāo)記率最大為97.8%,。當(dāng)反應(yīng)體系的pH>5.0時(shí),隨著pH增加,標(biāo)記率顯著下降,。這是由于在相對(duì)較高pH條件下,68Ga3+與反應(yīng)體系中的OH-產(chǎn)生大量的鎵膠體,致使標(biāo)記率大幅降低。

2.1.2 多肽DOTA-CA IX-P1-4-10濃度的選擇 在pH為4.5,、反應(yīng)溫度為100 ℃,、反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí),考察多肽DOTA-C A IX-P1-4-10濃度對(duì)標(biāo)記反應(yīng)的影響,標(biāo)記率隨多肽濃度的變化規(guī)律示于圖3。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記率隨著多肽濃度的增加而增加,當(dāng)反應(yīng)體系的多肽濃度大于40.0 mg/L時(shí),68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記率在95.0%以上,標(biāo)記率不再隨多肽濃度的升高而顯著增加,。

2.1.3 68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記條件確定 通過對(duì)標(biāo)記條件的探索研究,綜合考慮產(chǎn)品的放化產(chǎn)率和比活度,確定68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的標(biāo)記條件如下:反應(yīng)體系的pH為4.0～5.0,多肽DOTA-CAIX-P1-4-10濃度為15.0～40.0 mg/L,反應(yīng)溫度為100 ℃,反應(yīng)時(shí)間10 min,。當(dāng)多肽濃度為15.0 mg/L時(shí),標(biāo)記率為(86.8±2.7)%(n=6),對(duì)標(biāo)記率的Radio-TLC檢測譜圖示于圖4,反應(yīng)體系中除游離的68Ga3+外,未見其他放射性雜質(zhì)生成。

2.2 質(zhì)量控制

經(jīng)檢測,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10溶液為無色澄清液體,、無可見異物,pH為5～7(n=6),。通過Radio-TLC對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行檢測,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的比移值(Rf)為0.4～0.6(n=6),與前體多肽DOTA-CA IX-P1-4-10的一致,放化純度>99.0%(n=6),譜圖中未見明顯的放射性雜質(zhì)(圖5a)。通過Radio-HPLC對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行檢測,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的保留時(shí)間為4.0～4.2 min(n=6),與前體多肽DOTA-CA IX-P1-4-10的保留時(shí)間一致,放化純度>99.0%(n=6),無明顯的放射性雜質(zhì)(圖5b),。產(chǎn)品在合成結(jié)束時(shí),紫外譜圖示于圖5c,比活度為1.0～5.0 GBq/μmol(n=6),。

2.3 脂水分配系數(shù)(Log P)

68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的脂水分配系數(shù)為(-2.07 ± 0.01)(n=6),與68Ga標(biāo)記多肽類化合物的脂水分配系數(shù)相近[14-15],表明該探針具有良好的親水性,。

2.4 68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10的體外穩(wěn)定性

68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10在生理鹽水和胎牛血清中的穩(wěn)定性結(jié)果示于圖6,。37 ℃條件下,于生理鹽水和胎牛血清中孵育4 h,68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10的放化純度均>95.0%,表明68Ga-DOTA-CAIX-P1-4-10在生理鹽水和胎牛血清中具有良好的穩(wěn)定性,較本課題組曾報(bào)道的靶向CA IX的探針18F-CA IX-P1-4-10的體外穩(wěn)定性顯著提高[13]。

2.5 異常毒性

異常毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5只小鼠在給藥后48 h全部健存,無異常反應(yīng),。

本研究對(duì)靶向CA IX的探針68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的合成條件,、質(zhì)量控制、脂水分配系數(shù)及體外穩(wěn)定性進(jìn)行了初步研究,。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10的合成反應(yīng)簡單,、耗時(shí)短,10 min標(biāo)記率可達(dá)到(86.8±2.7)%(n=6),純化后放化純度>99.0%。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10在生理鹽水和胎牛血清中37 ℃孵育4 h,放化純度均>95.0%,表明其具有良好的體外穩(wěn)定性,。68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10無異常毒性,。初步評(píng)價(jià)結(jié)果表明,68Ga-DOTA-CA IX-P1-4-10具有進(jìn)一步的體內(nèi)生物學(xué)評(píng)價(jià)研究的價(jià)值。

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