本文是Alzheimer’s型老年癡呆（AD）的動物模型的制作,，首先介紹AD的病理特征和模型的制作原理,，然后著重介紹三類AD模型的制作方法。

由于AD的病理學機制尚不清楚,，要研究其發(fā)病機制和試驗新的治療方法,，一個重要的突破口是制作AD的動物模型，即在動物上模擬AD的病理改變和臨床癥狀,。制作AD動物模型的前提是對AD的病理和行為變化的充分認識,。

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一,、AD的病理改變

AD的主要病理學改變是患者腦組織出現(xiàn)大量神經(jīng)纖維纏結(jié)（Neurofibrillary Tangles,，NFT）、老年斑（Senile plaque）,，突觸和神經(jīng)元丟失,。NFT是出現(xiàn)在易感神經(jīng)元胞體和突起內(nèi)的絲狀物，可以通過鍍銀染色或免疫組化的方法將其顯示,。電子顯微鏡下NFT是由配對纏繞的螺旋絲或15nm的直絲所組成,。老年斑是神經(jīng)細胞外的斑塊狀沉積，它同樣可以通過鍍銀或免疫組化方法顯示,。NFT和老年斑在正常老年人腦組織也可出現(xiàn),，但在AD患者腦內(nèi)其數(shù)量顯著增多。它們主要沉積在額,、顳葉皮質(zhì)、海馬,、杏仁等腦區(qū),。累及上述腦的易感神經(jīng)元，使其功能喪失或死亡,。例如基底前腦膽堿能神經(jīng)元,、新皮質(zhì)和海馬的投射神經(jīng)元丟失，導致靶的突觸輸入的減少和失支配,，這些病理改變構(gòu)成了AD認知障礙和記憶減退的神經(jīng)基礎^[1-4],。

二、AD的分子標志和危險因子

近年來,，隨著分子生物學技術的滲入,，對AD發(fā)病的分子機制的認識有了長足的進步，其中最突出的成就是發(fā)現(xiàn)了AD有關的二大分子標志物：Tau蛋白和β-淀粉樣蛋白（β-amyloid protein,， Aβ）,。Tau是組成細胞骨架的微管相關蛋白（Microtubule associating protein）之一，由于某種原因引起Tau的異常磷酸化,，使其從微管上解離,，從面導致細胞骨架解聚，干擾了神經(jīng)細胞功能,，進而使受累神經(jīng)元死亡,。而過磷酸化的Tau本身相互纏繞形成了NFT^[5]；Aβ是一個由39～43個氨基酸組成的多肽，它來自于含695～770個氨基酸的前體蛋白（Amyloid procursor-like protein,，App）,。業(yè)已發(fā)現(xiàn)，Aβ沉積和老年斑形成有著密切的關系,，Aβ是老年斑的主要成份之一,。用Aβ的抗體免疫組化方法可顯示老年斑。App基因定位于第21號染色體,，在一些早發(fā)的家族性AD的患者其App基因突變已被證實^[6-8],。

除上述兩種分子物質(zhì)與AD發(fā)病有著密切聯(lián)系外，與AD發(fā)病有關的其它危險因子,，主要有年齡,、遺傳和載脂蛋白E4（Apolipoprotein E4，ApoE4）,。年齡因素是指AD的發(fā)病年齡通常在60歲以上,，且隨著年齡的增大發(fā)病率增加；遺傳因素是指約20～30%的AD患者有家族遺傳性,，其中的一部份已發(fā)現(xiàn)了基因的改變,。ApoE4是存在于血漿和腦脊液的脂蛋白成份之一，由人類19號染色體長臂上ApoE4基因位點上多個等位基因（ε4,、ε3,、ε2）所編碼。最近的研究發(fā)現(xiàn)AD患者ε4等位基因頻率比對照組顯著增高,，且AD的病變程度與ε4的等位基因頻數(shù)有關,。這些資料表明ApoE等位基因的多形性與AD的發(fā)病有著密切的聯(lián)系^[9]。

三,、AD動物模型的分類和制作原理

AD動物模型是在實驗動物身上模擬AD患者腦組織的病理變化和行為異常,，這是研究AD發(fā)病機制的重要手段，也可為試驗和判斷治療AD的藥物和療法提供試驗對象,。盡管完全理想的AD動物模型目前尚不存在,，但隨著神經(jīng)生物學和分子生物學的進步，許多種AD動物模型相繼被制作,，并在研究中得到廣泛的應用,，這些模型為理解AD的病理機制和試驗新的藥物發(fā)揮了重要作用。

現(xiàn)有的AD動物模型是根據(jù)不同實驗目的所設計的,，大多是只能模擬AD的某些病變或癥狀,，根據(jù)其制作方法和作用機制，AD動物模型可分為如下幾種（表1）：

表1  老年性癡呆動物模型的分類和制作原理

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      類     型                                   方   式                原     理

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前腦膽堿能系統(tǒng)損害模型

穹窿－海馬傘切斷模型       機械離斷           損傷隔-海馬膽堿能投射

IBO損害模型                   IBO腦內(nèi)注射       損毀基底前腦神經(jīng)元胞體

免疫毒素損害型                 腦室投遞           選擇性損毀基底前腦的膽堿能

                                                                   細胞

自然衰老認知障礙模型             迷宮篩選           從衰老鼠中篩選出有學習記憶

                                                                           損害的個體

慢性腦缺血癡呆模型             結(jié)扎腦供血動物     腦長期供血不足,，造成認知缺失

                                                                           和病理損害

OA損害模型                        腦室投遞OA            抑制蛋白磷酸化酶1A和2A

                                                                           剌激PKC的活性

轉(zhuǎn)基因動物模型                  App基因轉(zhuǎn)染            App／Aβ蛋白過渡表達

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（一）前腦膽堿能系統(tǒng)損害模型

該模型是建立在“AD認知障礙的膽堿能假說“的基礎上,，已知基底前腦的膽堿能細胞發(fā)出軸突廣泛地投射到新皮質(zhì)和海馬等高級腦區(qū)，這一投射與學習記憶和認知功能有著密切的聯(lián)系。在任何一個環(huán)節(jié)阻斷或損壞這一投射系統(tǒng)都可導致動物認知障礙和學習記憶能力的損害（圖1）,。病理檢查發(fā)現(xiàn)AD患者基底前腦的膽堿能細胞出現(xiàn)嚴重潰變,，其細胞丟失的程度和患者的認知能力成負相關關系^[10]。因此,，這一類AD模型主要著眼于模擬AD的認知缺失和前腦膽堿能系統(tǒng)損害,。根據(jù)損害方式的不同，這一類模型又可分為穹窿-海馬傘損傷模型,、Ibotenic酸損害基底前腦細胞模型以及基底前腦膽堿能細胞免疫切除模型,。

（二）自然衰老認知障礙AD動物模型

    AD是一個年齡相關的疾病，衰老因素在AD發(fā)病過程中扮演著重要角色,，衰老所特有的病理生理變化及其它病變的影響,，是用年輕動物制作的動物模型所不能替代的。近年來比較流行的模型之一是用老年的靈長類（彌猴,、恒猴,、羅猴）或鼠類，通過行為篩選的方式,，選擇帶有認知和記憶嚴重缺失的個體,，它們的行為損害與老年人和AD患者的認知損害相類似，同時還可出現(xiàn)某些相應的腦組織病理改變^[11],。

    （三）轉(zhuǎn)基因動物模型

轉(zhuǎn)基因AD動物模型是建立在App基因突變導致Aβ沉積是AD病理改變的中心環(huán)節(jié)的學說的基礎上,。用實驗的方法將外源性App基因（野生或突變型）導入，使其在染色體基因組中穩(wěn)定整合,、表達，并遺傳給后代,。動物過多地表達App基因或其突變基因產(chǎn)物,，引起Aβ的沉積和相關的病理損害或臨床癥狀。

轉(zhuǎn)基因的方法能夠直接試驗是否野生型或突變型的App,，或者Aβ包含片段的過度表達是AD的病因,，近年來這一領域的研究非常活躍^[11],。

（四）其它損害造成的AD動物模型

其它AD動物模型尚有老年動物慢性腦缺血癡呆模型,、Okadaic acid（OA）損害模型、鋁中毒模型和β-半乳糖損害模型,。慢性缺血癡呆模型是通過結(jié)扎老年大鼠的雙側(cè)頸總動脈和一側(cè)椎動脈或者一側(cè)鎖骨下動脈,，造成老年腦的長期供血不足和相應的腦損害，這些腦損害與AD的臨床表現(xiàn)和病理改變有一定相似性^[12],；OA損害模型是利用OA對絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸化酶（1A和2A）的特異性抑制作用,，以及它對蛋白激酶C（PKC）的激活作用。1A和2A抑制可以使Tau蛋白過磷酸化，導致NFT的形成,。同時,，PKC激活，1A和2A的活性抑制,，可剌激Aβ產(chǎn)生,，進而引起Aβ的沉積和老年斑的形成^[13]。

四,、AD動物模型的制作方法

（－） 穹窿海馬傘損害模型^[14,15]

     1．實驗動物：用雄性大白鼠（SD或Wistar鼠種）,，3～5個月齡，體重250～300克,。

2. 材料和試劑：腦立體定位儀,，特制刀片，注射器,，開顱鉆,。

     3. 操作程序：動物經(jīng)腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉后，固定于腦立體定位儀上,，顱頂區(qū)被皮常規(guī)消毒手術區(qū)皮膚,，無菌下操作，沿顱頂中線作長2cm切口,，用濕棉球分離骨膜,。于前囟后2.0mm，中線旁1mm處,，用牙科鉆或自制顱鉆打開顱骨,，仔細切開硬腦膜，暴露大腦皮質(zhì),，用特制的寬2mm雙刃刀片（剃須刀片制作）按照腦立體定位儀圖譜（Paxinos G and Watson C）,，于前囟后2mm，中線左側(cè)1mm處置刀于腦表面,，然后操作定位儀降刀4.1mm,，并向外向內(nèi)各移動1mm和0.5mm。然后再降刀1mm,，外移1.5mm,，此時上下抽動刀片數(shù)次，依次切斷胼胝體緣,、扣帶回,、背側(cè)穹窿-海馬傘（圖1，右側(cè)）,。留刀三分鐘后退出刀片,。手術中要避免損傷上矢狀竇,，并觀察有否出血現(xiàn)象，關閉頭皮,。另一種損害方法是分離和移除一部分大腦皮質(zhì),，直接暴露穹窿，直視下切斷穹窿或移除一段（1mm長）穹窿,。動物存活1周至2周,，灌注殺死動物，取基底前腦組織切片,，用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶（ChAT）免疫組化方法驗證,，損傷同側(cè)內(nèi)側(cè)隔核膽堿能神經(jīng)元較對照側(cè)減少50～60%左右，斜角帶垂直支約減少40%,。同時,，損傷側(cè)海馬內(nèi)膽堿能纖維（AchE染色）明顯減少。迷宮測試顯示該模型鼠的獲取能力和記憶能力勻較對照組明顯降低,。

（二）鵝膏蕈氨酸（Ibotenic acid, IBO）損害模型

IBO是一種谷氨酸受體激動劑,，具有強烈的神經(jīng)興奮毒性作用，通過與神經(jīng)元胞體或樹突上的NMDA受體相結(jié)合導致神經(jīng)元中毒性損傷而潰變,?；诨浊澳X神經(jīng)元丟失在衰老和AD有關的認知缺失中的重要作用，以谷氨酸類似物微量注射到基底前腦導致其神經(jīng)元潰變和認知缺陷,，在大鼠和猴都已被模擬了,。制作AD模型最常用的谷氨酸類似物主要有海仁酸（Kainic acid，KA）,、IBO和使君子氨酸（quisqualic,，QUIS）。其中以IBO最為首選,，盡管IBO和QUIS都能造成基底前腦膽堿能神經(jīng)元潰變,，但只有IBO能恒定地損害動物與學習記憶有關的行為執(zhí)行?；浊澳X細胞對KA的敏感性較低，故用量較大,，易引起動物死亡,，并往往在導致基底膽腦細胞損害的同時引起其它部位神經(jīng)元（如海馬錐體細胞）的死亡^[16,17]。

1. 實驗動物：以SD,、Wistar或Long-Evant等純種大鼠皆可,，鼠齡以3～5個月或18～22個月為宜，體重300克左右,。

2. 材料和試劑：腦立體定位儀,，微量注射器,，Ibotenic acid。

2. 操作程序：動物經(jīng)戊巴比妥鈉（40mg／kg）腹腔麻醉后,，固定于腦立體定位儀,，頭皮被皮，切口和開顱同前,，參照立體定位坐標,，耳桿＋0.2，中線外0.3,，顱骨下7.0推進微注射針,，每點注射IBO 0.5μl（0.05M），注射時間持續(xù)2～3min,，留針5min,，以防擴散，緩慢退針后縫合頭皮,，動物存活一周后以相同座標行對側(cè)損害注射,。對照組取同樣座標，但深度座標減1mm,，進針后不注射任何物質(zhì),。

    (三) 自然衰老認知障礙鼠模型──行為篩選

    1. 自然衰老認知障礙大鼠^[18,19]

（1）實驗動物：鼠的平均壽命在30個月左右，通常大鼠24個月,，小鼠18～20個月以上視為老年鼠,，選擇22～24個月純種同性大鼠50只左右，雌雄皆可,，3～6個月青年鼠為對照,，15只左右。正常光暗周期飼養(yǎng),。

（2）行為檢測工具：Morris水迷宮裝置如圖2,。Morris水迷宮主要由水池和記錄系統(tǒng)兩大部分組成。水池直徑130cm,，高50cm,，池內(nèi)水深30cm，水溫保持在24±2℃,，水面覆蓋一層直徑0.5cm大小塑料泡沫顆粒,。水池放置在房間的中央。池壁上依次標上N,、E,、S、W字母,，將水池分為四個象限,，任選一象限放置平臺（平臺與圓心和池壁等距）,。平臺由透明有機玻璃制作，圓形,，直徑10 cm,，高28 cm，沒于水下2 cm,，記錄系統(tǒng)包括攝象機,、監(jiān)視器和錄像系統(tǒng)，攝像機裝在水池上方3米處,，小錄音機提供固定的背景音樂,，減少噪音干擾。

（3）行為測試

①定位航行試驗（Place navigation）：試驗前一天將大鼠放入水池（不含平臺）自由游泳2分鐘,，讓其熟悉迷宮環(huán)境及游泳,，試驗共歷時5天，每天分上,、下午兩時間段,。訓練開始時，將平臺置于一個固定的象限,，每個時間段分別從池壁四個起始點將大鼠面向池壁放入水池,，記錄每次找到平臺的時間（逃壁潛伏期，escape latency）和游泳路徑,。如大鼠在120秒內(nèi)找不到平臺,，由實驗者將其引上平臺，潛伏期記為120秒,，每次間隔4分鐘讓大鼠休息,，再行下次試驗。

②空間探索試驗（Spatial probe test）：第5天上午時間段撤除平臺將大鼠從任選的非平臺象限入水點面向池壁放入水中,，記錄2分鐘內(nèi)大鼠在池中的游泳路徑,。然后，分析大鼠在平臺象限游泳路徑長度占總路徑長度的百分比,。

以年青組大鼠平均逃避潛伏期均數(shù)＋2倍標準差值為下限,，＋1倍標準差值為上限，將老年大鼠化為二組,。平均逃避潛伏期大于均數(shù)＋2倍標準差的為老年癡呆組,，小于均數(shù)＋1倍標準差為老年正常組。潛伏期介于上下限之間的老年鼠因不能確定它們的組屬,，為避免混淆,，從實驗中剔除

2. 衰老的非人靈長類（猴）

靈長類在神經(jīng)生理,、結(jié)構(gòu)和行為上最為接近人類,，用非人靈長類制作AD模型,，猴是較為適宜的^[20]。羅猴的平均壽命是35歲,，行為學研究表明10歲以上羅猴即開始出現(xiàn)認知和記憶能力的減退,，到15～20歲時上述認知和記憶的缺失變得更為明顯，與衰老的人類和AD患者的認知障礙相類似,。病理學分析表明大于20歲的老年猴腦組織出現(xiàn)Aβ淀粉樣沉淀,、潰變的神經(jīng)軸突和特異性神經(jīng)遞質(zhì)紊亂，如Ach和去甲腎上腺素的減少,。這些改變通常較衰老的人類和AD患者要輕,，但有較大的個體差異。就個體而言其認知能力損害的程度與其病變程度呈相關關系,。因此,，用行為檢查的方式篩選出帶有認知損害的老年猴子作為AD模型有其特有的優(yōu)勢。但用20歲以上猴子為實驗對象,，其來源,、經(jīng)濟成本和實驗周期長等因素限制了該模型的應用。

（四）免疫毒素切除基底前腦膽堿能細胞模型

免疫毒素（immunotoxin）192-IgG-SAP能夠選擇性地破壞基底前腦的膽堿能細胞,，而留下基底前腦的其它化學屬性的細胞成份,，如GABA、P物質(zhì)和丙苷肽等陽性神經(jīng)元,。192-IgG-SAP是由抗大白鼠的低親和神經(jīng)營養(yǎng)因子受體（p75）的抗體Mab（192-IgG）與Saporin相結(jié)合而成,，SAP是一種來自植物種子（Saponaria officinalis）的核糖體失活蛋白。192-IgG能夠被BF膽堿能神經(jīng)元選擇性的攝取,，進入細胞后Saporin逃漏出細胞的內(nèi)化池,，通過破壞蛋白合成酶系統(tǒng)殺死膽堿能細胞^[21,22]。

1. 實驗動物：選用純種SD,、Wistar或Long-Evants大鼠均可,，體重250～300克。

2. 材料和試劑：腦立體定位儀,，微量注射器,，免疫毒素，192-IgG-SAP,，商品代號是MAB390（chemicon communications）,。使用前溶解在pH7.4的PBS，貯存-70℃冰箱備用,。

    3. 操作程序：腹腔注射戊巴比妥鈉（40mg／kg）麻醉后,，固定于腦立體定位儀上，門齒線在耳桿水平下3.3mm,，行雙側(cè)側(cè)腦室注射192-IgG-SAP,，每側(cè)100ng,，1μl，腦室注射座標為：前囟-0.3,，旁1.3,，深3.6。也可直接行內(nèi)側(cè)隔核內(nèi)注射10ng／0.03μl,。注射時間持續(xù)2min,，留針5分鐘。5～7天后殺死動物,，制作基底前腦切片,，用膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶免疫組化方法顯示膽堿能神經(jīng)元破壞情況。圖4顯示腦室投遞MAB390后第五天,，內(nèi)側(cè)隔核ChAT的染色情況,。A.腹腔注射MAB390內(nèi)側(cè)隔核膽堿能細胞完好。B.腦室注射MAB390后第5天內(nèi)側(cè)隔核ChAT陽性細胞絕大多數(shù)丟失,。行為測試顯示經(jīng)192-IgG-SAP處理的大鼠學習記憶能力受到明顯損害,。

（五）Okadaic acid慢性損害AD模型

Okadaic acid（OA）是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸化酶（1A和2A）的特異性抑制劑，OA的長期腦室投遞可引起動物的記憶嚴重缺失,，同時導致腦內(nèi)Aβ淀粉樣沉積斑塊形成以及NFT樣磷酸化Tau蛋白出現(xiàn),。

    投遞裝置用ALZA公司的ALZET微滲透泵（Model 2004），使用前充填OA溶液,。

1. 實驗動物：用SD或Wistar大鼠,，體重250～300克。

2. 材料和試劑：腦立體定位儀,，微量注射器,，顱鉆。OA選用Sigma公司產(chǎn)品,，產(chǎn)品編號是0-1506,，以pH7.4的磷酸緩沖的人工腦脊液配制，置4℃冰箱備用,。

3. 操作程序：動物麻醉后固定于腦立體定位儀,。參照腦立體定位圖譜的側(cè)腦室座標，顱骨鉆孔,，裝置微滲透泵的投遞針,，使針管頭端置于側(cè)腦室，用牙科水泥將其柄部固定在顱骨上,，泵體埋在動物項部皮下,，輸送管經(jīng)頭皮下傳送。平均投遞速度0.25±0.02μl／小時，通常一次埋泵可維持4周,，如需要長時間的投遞,，更換一次新充填的微滲透泵即可。2～3周后進行行為試驗,，動物將出現(xiàn)工作記憶和參考記憶的損害。術后6周免疫組化分析可見經(jīng)OA處理的大鼠腦的紋狀體,、海馬和皮質(zhì)等部位出現(xiàn)高磷酸化Tau蛋白免疫陽性神經(jīng)元,、App免疫陽性星形膠質(zhì)細胞和Aβ淀粉樣蛋白免疫陽性斑塊^[13]。

（六）慢性缺血癡呆模型

腦的供血不足可以導致腦損傷和一系列的臨床癥狀,，加拿大學者Torre報告用老年動物慢性腦缺血模型引起的行為缺失和腦組織病理生理改變在許多方面與人類的老年期癡呆包括AD相類似^[12],。

1. 實驗動物：用14～16個月雄性SD或Wistar大鼠。

2. 材料和試劑：腦立體定位儀,，手術顯微鏡,，單極或雙極電凝器，顯微手術器械,。

3. 操作程序：大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉腹腔麻醉（40mg／kg）,，固定于腦立體定位儀。硅膠管或橡皮栓扎鼠尾輕輕牽引,，使頸椎伸展,，翼孔呈水平位，便于觀察,。消毒頭皮后,，枕骨下第一頸椎水平正中切口，仔細分離一側(cè)第一頸椎橫突,，暴露第一頸椎橫突翼孔,，翼孔下有椎動脈通過。用小的單極或雙極電凝器插入翼孔燒灼閉塞一側(cè)椎動脈,。然后,，動物取背位，取頸部正中切口,，分離頸總動脈,，注意避免損傷迷走神經(jīng)和鞘后方的頸交感干。結(jié)扎和切斷一側(cè)的頸總動脈,，用外科縫線套住另一側(cè)頸總動脈（不結(jié)扎）,，將線頭藏于皮下，簡單關閉切口,。待動物麻醉清醒后送回飼養(yǎng)籠,，自由飲水，但禁食。12～24小時后,，將動物于清醒狀態(tài)下取背位,，分別用繩子固定四肢和門齒，以控制動物掙扎,。小心分離頸前部的切口,，辯認套在未結(jié)扎側(cè)頸總動脈上的縫線，輕輕牽起,，結(jié)扎和切斷該側(cè)的頸總動脈,，縫合皮膚切口。對照組動物經(jīng)歷同樣的手術程序和血管暴露,，但未行椎動脈燒灼和頸總動脈結(jié)扎,。

術后動物存活10～12周，此時皮質(zhì)和海馬的腦血流分別較對照組減少20%和60%,。Morris水迷宮測試顯示空間記憶能力缺失明顯,，組織學檢查證實，海馬神經(jīng)元丟失,，膠質(zhì)纖維酸性蛋白免疫反應增強,，以CA1區(qū)最明顯。雖然經(jīng)歷了慢性缺血,，但受缺血動物腦內(nèi)并未發(fā)現(xiàn)梗塞灶,。

（七）轉(zhuǎn)基因動物模型

轉(zhuǎn)基因動物的制作是一個復雜的專門技術，本節(jié)不能將其技術全面介紹,。鑒于各種轉(zhuǎn)基因的制作的基本程序相似,，詳細細節(jié)請參閱有關文獻^[23]。AD轉(zhuǎn)基因的動物模型近年來的進展非常迅速,，各種AD轉(zhuǎn)基因模型不斷被報道?，F(xiàn)有的模型大多數(shù)是將不同結(jié)構(gòu)的App基因轉(zhuǎn)移到受精卵，但真正理想的轉(zhuǎn)基因模型尚不多見,。Games D等（1995）報道了App突變體（Val⁷¹⁷-Phe）轉(zhuǎn)基因小鼠,，顯示了老年斑、Aβ沉積等AD的病理改變,，該模型認知能力尚不清楚,。轉(zhuǎn)基因鼠（JU）表達人野生型App751，顯示了空間記憶的損害,，但只有4%的轉(zhuǎn)基因鼠飼養(yǎng)到12個月以上才展示了Aβ的沉積,，且Aβ沉積的量很少，不能被剛果紅染色^[24],。最近Hsiao K等報道用人的App595基因進行轉(zhuǎn)染,，該App595是來自瑞士一個家庭性AD,，含有雙突變點（lys⁹⁷⁰-Asn，Met⁶⁷¹-Leu）,。將突變基因的DNA插入到金黃地鼠的prion蛋白（hamster prion protein,，PrP）質(zhì)粒載體，其PrP開放讀碼框架（ORF）被改變的App ORF所替代,，結(jié)果TG⁺（HuAPP695,、K670N-M671L）2576鼠飼養(yǎng)到14個月時出現(xiàn)了空間學習和記憶的損害，同時Aβ（1-40）表達量較Tg^-鼠高出4倍,，大量Aβ陽性斑在腦組織內(nèi)沉積,。提示這一轉(zhuǎn)基因AD模型在很大的程度上模擬了AD的臨床癥狀和病理改變^[25]。

轉(zhuǎn)基因動物制作的簡單程序如下：

①引物設計App或Aβ區(qū)段的靶基因的制備

②重組靶基因顯微注射小鼠受精卵

a. 對C57BL／6雌鼠（供體）腹腔注射孕馬血清,，誘發(fā)卵巢濾泡發(fā)育；

b. 48小時后注射HCG,，然后與雄鼠交配,，使之超數(shù)排卵；

c. 翌晨觀察雌鼠陰道栓形成,，從見栓雌鼠輸卵管回收原核受精卵,；

d. 向受精卵雄原核內(nèi)顯微注射入線性化的App或Aβ區(qū)段的靶基因；

e. 體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因的受精卵至晚期桑椹胚,。

③轉(zhuǎn)基因桑椹胚移植入假孕受體

a. 結(jié)扎雄性小鼠的輸精管后使之多次交配,，令殘存精子排盡并經(jīng)檢測精液證實無活精子存在；

b. 在供體C57BL／6雌鼠配種后一天,，用結(jié)扎雄鼠與昆明雌鼠交配,，見陰道栓形成的雌鼠留作假孕受體之用；

c. 將體外培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因桑椹胚植入假孕受體雌鼠子宮角,。

④轉(zhuǎn)基因鼠的組織檢測

子鼠出生后三個月從鼠尾取血提取DNA以PCR檢測App基因篩選轉(zhuǎn)基因體,。然后，進行非同胞間交配,，使其后代進行遺傳學觀察,。用第一代或第二代鼠飼養(yǎng)到10個月以后，行為學測試分析其學習記憶能力,，取腦組織作下列檢測：a. Southern雜交檢測App cDNA的整合,；b. Northern雜交和RT-PCR檢測App RNA轉(zhuǎn)錄；c. 免疫組化檢測App表達和腦組織內(nèi)Aβ免疫陽性斑塊的形成情況,。

五,、AD動物模型的應用和評價

（一）前腦膽堿能系統(tǒng)損害模型

該模型通過手術、化學或免疫切除的方式損傷基底前腦-海馬膽堿能投射,，從而模擬AD的前腦膽堿能系統(tǒng)的損害,。這一類模型主要用于：1. 研究前腦膽堿能系統(tǒng)選擇性損害與AD的記憶減退和認識障礙等臨床癥狀的關系和機制；2. 擬膽堿藥物治療AD的藥物篩選、療效評價和作用機制的研究,；3. 胚胎基底前腦膽堿能細胞腦內(nèi)移植治療AD的實驗研究,；4. 神經(jīng)營養(yǎng)因子如NGF等腦室投遞治療AD的研究以及NGF或其它神經(jīng)營養(yǎng)因子基因修飾細胞腦內(nèi)移植對AD進行基因治療的研究等。膽堿能損害模型的三種損害方式在用于上述不同研究目的時其作用又有所不同,。實驗時應根據(jù)需要選擇,。比如，研究NGF或轉(zhuǎn)基因細胞對AD的治療應選擇隔-海馬切斷模型,。因為該模型前腦膽堿能神經(jīng)元胞體尚存,，NGF可以促進其修復、軸突再生或抽芽,。如果研究膽堿神經(jīng)元選擇性損害與AD認知障礙的關系則應選擇免疫毒素切除模型較理想,，因為這樣可以排除其它化學屬性神經(jīng)元損害對結(jié)果的干擾。

（二）自然衰老認知障礙模型

自然衰老認知障礙模型是基于不同的個體對衰老的易感性不同,，通過行為篩選的方式將衰老并具有明顯認識障礙的個體選出,。該模型的特點是自然衰老，其神經(jīng)系統(tǒng)的損害亦屬自然發(fā)生,，因此我們認為該模型適合于中藥治療AD的篩選和療效評價,，如果將此模型和其它損害模型相結(jié)合適用于其它方法治療AD的研究。

（三）慢性腦缺血癡呆模型

該模型的二個特點是：1. 腦組織長期供血不足,；2. 只有老年動物長期缺血才出現(xiàn)恒定的行為損害和病理改變,，年輕動物長期缺血造成的損傷是一過性的?；谠撃Ｐ偷闹谱鳈C理和特點,，考慮到臨床上有不少AD患者同時合并有腦血管型癡呆和腦供血不足，我們認為這一模型適用于研究混合性老年期癡呆的發(fā)病機制和有關藥物治療的研究,。

（四）OA損害模型

由于OA對蛋白磷酸化酶1A和2A的抑制作用和提高PKC的活性,，并能同時復制出AD的二大分子標志有關的病理改變──老年斑和NFT，該模型具有明顯的優(yōu)勢主要適用于：①研究AD發(fā)病的病理機制,，Aβ和Tau蛋白代謝異常與AD病理的關系,，以及Aβ和Tau在AD病變中的相互作用。②從另一角度驗證現(xiàn)有AD治療方法和藥物的療效,。

（五）轉(zhuǎn)基因動物模型

    App的表達和代謝型異常是AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié),該模型主要用于研究：①是否App（野生或突變）或者含Aβ片段基因的過渡表達與AD的病理改變有關,；②AD患者App或Aβ異常表達的分子機制；③AD時App或Aβ的代謝發(fā)生了什么變化及其與老年斑形成的關系,；④試驗新的AD治療藥物,。

總之，AD的動物模型有多種類型,，大致可概括為損害模型,、自然衰老模型和轉(zhuǎn)基因動物模型三大類,。每一種模型都在一定的程度上或某些方面模擬了AD的癥狀和病理改變。它們各自具有自己的適用范圍和作用,，又各有優(yōu)勢和不足,。因此，每一個需要應用AD動物模型的研究者,，首先必需熟悉AD的基本病理改變和臨床表現(xiàn),，了解各種模型的原理和特點，根據(jù)自己的實驗目的選擇合適的模型,。近年來,，AD動物模型的研究進展非常迅速，隨著我們對AD發(fā)病的細胞分子機制認識的不斷深入,，新的動物模型將繼續(xù)出現(xiàn),。如ApoE4的Knock-in動物模型和早老蛋白（Presenlin, PS）的轉(zhuǎn)基因動物模型可能不久將會問世。現(xiàn)有動物模型也將不斷得到改進,，而AD動物模型制作和研究的進展,，又將進一步促進我們對AD的發(fā)病機制的了解和推動其藥物治療研究的進步。

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