各位老師，大家好！

我是“一麥眾承”第20小組“麥上希望”的張榮志,，按照組長曹新有老師安排,，代表小組值日。我們小組還有馬玲玲老師,、胡海燕老師,、楊秦棟老師、李紅彬老師,、李前榮老師,、夏中華老師、陳亮老師,、朱昌濤老師,、陳建省老師、李清峰老師,、楊永樂老師和呂慶豐老師等,。非常感謝陳紅敏老師搭建平臺，為小麥人提供學(xué)習(xí)和交流渠道,。借此機會,，向大家匯報“小麥雄蕊發(fā)育相關(guān)小分子RNA”方面的一點工作進展。

一,、PhasiRNA簡介

在植物中，存在一類特殊的PHAS (phasiRNA producing loci) 基因或者位點,。PHAS轉(zhuǎn)錄本含有miRNA的識別位點,，在miRNA的作用下，單鏈的PHAS前體被RISCs切割后在RDR6 (RNA DEPENDENT RNA POLYMERASE 6)的作用下形成雙鏈,，這個雙鏈RNA再由DICER-LIKE4 (DCL4)或者DCL5切割后產(chǎn)生頭尾相連按相位依次排列的21-nt或24-nt長的phasiRNA (phased secondary siRNAs),。這些phasiRNA可以與對應(yīng)的AGO蛋白如MEL1 (MEIOSIS ARRESTED AT LEPTOTENE1 MEL1)等結(jié)合，以順式或者反式的方式作用于下游的靶位點,。PhasiRNA主要參與植物的生長發(fā)育,、生殖發(fā)育和抗逆反應(yīng)等方面。在禾谷類植物中,，存在一類與生殖發(fā)育相關(guān)的phasiRNA,，這類小分子RNA與花粉發(fā)育直接相關(guān)。

二,、小麥中的phasiRNA

普通小麥?zhǔn)且粋€典型的異源六倍體作物,，基因組來源于具有較高同源性的三個二倍體物種和一個四倍體物種。這些不同倍性的祖先種和中間物種在小麥形成過程中得以保留,，對研究小麥的多倍化問題提供了重要的資源,。本研究以小麥為研究對象，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的261個小麥的小分子RNA庫，通過生物信息學(xué)分析,，在小麥基因組中鑒定了一批PHAS位點和phasiRNA,。這些phasiRNA在小麥的幼穗和花藥組織中特異表達(dá)（圖1）。這些PHAS位點多數(shù)是由miR2118或者miR2275介導(dǎo)產(chǎn)生21-nt或者24-nt的phasiRNA (圖2),。

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圖1. 在根,、莖、葉,、幼穗,、旗葉和籽粒中，小麥基因組中鑒定的21-nt（A）和24-nt (B) PHAS位點數(shù)分布,。FL,，旗葉；DR,、FM,、AM和TS分別表示二棱期、小花原基時期,、雌雄蕊分化期和四分體時期的幼穗,；1.0、1.5,、2.2和3.0 mm表示花藥的長短,；5、10,、20d代表授粉后5天,、10天和20天的籽粒

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圖2. 在PHAS基因區(qū)域，miRNA靶位點的預(yù)測和切割位點驗證,，及phasiRNA的分布,。序列配對區(qū)域為靶基因和miRNA的互補區(qū)域；方框內(nèi)的區(qū)域為降解組檢測到的reads數(shù),，紅色圓點為切割基因組位點的reads數(shù)分布,；方框下部分為phasiRNA的在該轉(zhuǎn)錄本上的相位分布，紅色和藍(lán)色線分別代表正鏈和負(fù)鏈方向的phasiRNA

三,、六倍體小麥中PHAS位點的進化

PHAS位點在小麥基因組中,，多數(shù)是單拷貝的。它們在部分同源染色體(subA,、subB和subD)之間的分布表現(xiàn)出了隨機的局部優(yōu)勢,；通過比較分析這些PHAS位點與小麥的二倍體祖先種(AA和DD)和四倍體祖先種(AABB)基因組的親緣關(guān)系，發(fā)現(xiàn)分布在小麥subA或者subD基因組上的PHAS位點多數(shù)起源于祖先種AA或者DD基因組,，分布在subA和subB基因組上的PHAS位點多數(shù)起源于祖先種AABB基因組,。這表明麥族PHAS位點可能具有較強的物種特異性，它們之間的分化可能至少早于四倍體AABB祖先種形成之前（圖3）

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圖3. 小麥PHAS位點在小麥（紅色線，從外圈往內(nèi)數(shù)第二圈）,、祖先種AA（紫色線,，從外圈往內(nèi)數(shù)第三圈）、AABB（藍(lán)色線,，從外圈往內(nèi)數(shù)第四圈）和DD（綠色線,，從外圈往內(nèi)數(shù)第五圈）基因組上的同源性分布。最外圈為小麥的染色體條帶分布

四,、小麥phasiRNA合成路徑中DCL4,、DCL5和RDR6突變體的創(chuàng)制

這些phasiRNA在小麥的花藥中特異表達(dá)，表明其可能參與小麥雄蕊的發(fā)育過程,。那么參與雄蕊發(fā)育相關(guān)的phasiRNA合成路徑中的基因理論上也與小麥的花藥發(fā)育相關(guān),。因此，我們挑選了phasiRNA合成路徑中DCL4,、DCL5和RDR6基因,，利用基因編輯技術(shù)分別成功創(chuàng)制了它們的突變體（圖4）?；蚓庉嫿Y(jié)果發(fā)現(xiàn),，這三個突變體都產(chǎn)生了雄性不育的表型（圖5）。Dcl4,、rdr6和dcl5不育突變體的花藥表型非常類似,，與對照Fielder相比，比較瘦小(圖5A & C),。Dcl4不育突變體,，株型變得十分矮小（圖5D）,，穗子變短變細(xì)（圖5B）；rdr6不育突變體,，株型雖與對照類似,，但一半分蘗不育，一半分蘗可育（圖5D）,；而dcl5不育突變體,，株型、穗型都與野生型類似（圖5B & D）,，即除了不育外,，沒有不利的農(nóng)藝性狀。

圖4. Dcl4,、dcl5和rdr6不育突變體的編輯類型

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  圖5. Dcl4,、dcl5和rdr6不育突變體和野生型的花藥(A和C)、穗子(B)和植株(D)的表型。白色箭頭為不育的穗子

對照材料的花粉,，用碘化鉀染色后,，在顯微鏡下可觀察到黑紫色的飽滿的圓形顆粒(圖6)。與對照相比,，dcl4,、rdr6和dcl5不育突變體的花粉用碘化鉀染色后，多數(shù)顆粒表面凹陷,、不飽滿,，呈黃色，這樣的花粉沒有受精能力,，花粉表現(xiàn)為敗育,，導(dǎo)致籽粒灌漿不能進行。而rdr6不育突變體的可育分蘗的花粉,，有一半表現(xiàn)為黑紫色的飽滿的圓形顆粒,，有一半表現(xiàn)為黃色的不飽滿的皺縮的花粉顆粒 (圖6)。從花粉的數(shù)量上,， dcl4不育突變體和rdr6不育突變體的花粉量明顯的少于對照(圖6),。而dcl5不育突變體的花粉量與對照相當(dāng)(圖6)。

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圖6. 野生型,、dcl4,、dcl5和rdr6突變體中，碘化鉀染色后的花粉和掃描電鏡觀察到的花粉形態(tài)

五,、DCL4,、DCL5和RDR6基因參與小麥的減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育過程

Dcl4和rdr6的小麥突變體中，均是只有部分花粉母細(xì)胞可以通過減數(shù)分裂過程,，因此可觀察到的成熟花粉粒較少（圖6）,。在減數(shù)分裂的配對期和染色體排列在赤道板上這倆個時期，dcl4突變體的個別染色體都有滯后現(xiàn)象,，在二分體和四分體時期,，出現(xiàn)多核現(xiàn)象，最終導(dǎo)致分裂的異常,。Rdr6突變體主要表現(xiàn)為二分體和四分體分裂時細(xì)胞間有黏連,，不能徹底分離。Dcl5突變體的減數(shù)分裂過程正常,，但當(dāng)四分體分化為小孢子后,，在小孢子出現(xiàn)萌發(fā)孔后，開始變得異常,，不能發(fā)育為成熟的小孢子,，并且有部分小孢子出現(xiàn)了倆個萌發(fā)孔（圖7）,。這表明DCL4和RDR6基因參與了小麥花粉母細(xì)胞的減數(shù)分裂前期過程，而DCL5基因只參與小孢子的發(fā)育過程,。

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圖7. 野生型和dcl4,、dcl5和rdr6突變體的減數(shù)分裂過程

六、DCL4,、DCL5和RDR6基因參與小麥21-nt和24-nt phasiRNA的合成

通過對野生型和突變體的雌雄蕊分化期（AM）和四分體時期（TS）的小分子RNA測序,，發(fā)現(xiàn)dcl4突變體中在這兩個發(fā)育時期均未檢測到21-nt的PHAS位點，但24-nt PHAS位點與野生型差異不明顯,；在rdr6突變體中,，21-nt和24-nt的PHAS位點數(shù)均顯著的少于野生型；在dcl5突變體中,，在TS時期,，幾乎沒檢測到24-nt PHAS位點。這說明DCL4和DCL5基因分別參與小麥21-nt和24-nt phasiRNA的合成,，而RDR6基因同時參與小麥21-nt和24-nt phasiRNA的合成（圖8）,。

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圖8. 在雌雄蕊分化期（AM）和四分體時期（TS），PHAS位點在野生型和dcl4,、dcl5和rdr6突變體中的分布

七,、PhasiRNA的靶基因參與花粉的發(fā)育過程

通過靶基因預(yù)測和降解組的數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)phasiRNA可以靶向編碼基因的cds,、5’-UTR和3’-UTR區(qū)域,，以及非編碼RNA（圖9）。有些phasiRNA的靶基因,，功能主要富集在了減數(shù)分裂過程,，比如微管的移動、核和染色質(zhì)的甲基化修飾等,；而有些靶基因則參與絨氈層的分化,，花粉壁的發(fā)育，以及孢粉素（小孢子和花粉外壁的主要成分）的代謝過程（圖10）,。

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圖9. 降解組數(shù)據(jù)證明phasiRNA的靶基因切割位點

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          圖10. PhasiRNA的靶基因的功能富集分析

綜上所述,，在小麥雄蕊的發(fā)育過程中，存在大量的phasiRNA參與小麥的雄蕊發(fā)育過程,。我們可以挑選phasiRNA合成路徑中的關(guān)鍵基因如DCL5、phasiRNA及它們的靶基因等,，通過基因編輯技術(shù)創(chuàng)制小麥的雄性不育突變體,，為雜交小麥提供候選供體親本。

參考文獻(xiàn)

1. Zhang R, Huang S, Li S, Song G, Li Y, Li W, Li J, Gao J, Gu T, Li D, Zhang S, Li G. Evolution of PHAS loci in the young spike of Allohexaploid wheat. BMC Genomics. 2020 Mar 4;21(1):200. doi: 10.1186/s12864-020-6582-4.

2. Zhang R, Zhang S, Li J, Gao J, Song G, Li W, Geng S, Liu C, Lin Y, Li Y, Li G. CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis of TaDCL4, TaDCL5 and TaRDR6 induces male sterility in common wheat. Plant Biotechnol J. 2023 Apr;21(4):839-853. doi: 10.1111/pbi.14000.