單細胞免疫組庫可以額外做啥,？

scTCR可以更細致的獲取腫瘤免疫微環(huán)境的變化,，比如單細胞轉錄組可以獲取不同樣本,，不同分組（癌和癌旁,，是否治療,，是否響應）的celltype組成,，可以知道哪些celltype發(fā)生變化,。

而TCR可以進一步的得知發(fā)生變化的celltype中clone擴展情況如何，治療響應組中clone是變多了還是變少了,？不同celltype之間是否共享一些clone,？是否出現(xiàn)了noval的clone？clone最多的TCR序列是哪些,？這些序列和哪些peptide結合最強,？是否可以用于CAR-T或者TAR-T治療等等。

本系列會使用2021年Cancer Cell文章“Single-cell sequencing links multiregional immune landscapes and tissue-resident T cells in ccRCC to tumor topology and therapy efficacy”中的部分樣本作為示例展示TCR的常見應用場景以及可視化,。

該數(shù)據(jù)集的多個樣本都有多處采樣位置,，多數(shù)樣本同時含有RNA和TCR數(shù)據(jù)，且含有治療前后的數(shù)據(jù),，ICB響應與否的數(shù)據(jù),，非常適合免疫組庫系列分析的練習。

Pubmed中找到該文章,，然后在Data Availability Statement 中發(fā)現(xiàn)文章的原始數(shù)據(jù)在PRJNA705464,，下載原始的sra文件來開啟 “從0開始scVDJ”的系列分析。

1,，數(shù)據(jù)集下載

在瀏覽器輸入https://www.ncbi.nlm./Traces/study/,，在Accession 中輸入BioProject的ID號（PRJNA705464）， 下拉找到以下信息,，就可以開始下載了,，介紹以下兩種下載方式

（1）可以點擊具體的Run，然后找到Data Access ,，獲取下載鏈接后進行下載,。

（2）也可以獲取第一列的SRR信息，使用SRAToolkit的prefetch進行批量下載

1.1 安裝SRAToolkit

可以在https://github.com/ncbi/sra-tools/wiki/01.-Downloading-SRA-Toolkit的鏈接中選擇合適的SRAToolkit下載 或者通過wget方式獲取

wget https://ftp-trace.ncbi.nlm./sra/sdk/3.0.2/sratoolkit.3.0.2-centos_linux64.tar.gztar zxvf sratoolkit.3.0.2-centos_linux64.tar.gz

1.2 prefetch下載數(shù)據(jù)

（1）單個Run下載

prefetch 后面添加上SRR的ID號即可 ,，prefetch建議使用絕對路徑 , 可以添加--max-size 100G 參數(shù),。

/path/prefetch SRR13806045  --max-size 100G

（2）SRR_ACC_List 批量下載（一列SRR編號的文件）

/path/prefetch --option-file SRR_ACC_List.txt

（3）shell循環(huán)下載

cat SRR_ACC_List.txt |while read i; do/path/prefetch $i  done

軟件建議使用絕對路徑。

2 sra文件轉為fastq

使用sratoolkit中的fastq-dump命令將 sra 轉化為 fastq 文件,。

進入到sra數(shù)據(jù)的存儲文件夾中,，可以用下述代碼進行批量的格式轉化：

cat SRR_ACC_List.txt |while read i; do/path/.../fastq-dump --split-3 $i done

注：--split-3 filename其中--split-3參數(shù)代表著如果是單端測序就生成一個 .fastq文件，如果是雙端測序就生成_1.fastq 和*_2.fastq 文件,。

3 修改cellranger 輸入格式

得到fastq文件后,，還需要轉為cellrange 分析需要的格式（比如,，將得到的SRR_1.fastq.gz改為SRR_S1_L001_I1_001.fastq.gz）。

可以使用上述方式進行批量修改,，但是要注意生成文件的個數(shù),，如果像本示例中產(chǎn)生的是R1和R2文件，那就將原來_1的改成R1,，將_2改成R2,。

#創(chuàng)建SRR_ACC_List.txt ，內容為SRR號cat SRR_ACC_List.txt| while read i ;do mv ${i}_1*.fastq.gz ${i}_S1_L001_R1_001.fastq.gz;mv ${i}_2*.fastq.gz ${i}_S1_L001_R2_001.fastq.gz);done

注：樣本名稱不要有下劃線"_",，可以是短線"-",。

首先進行cellranger的下載和安裝，參照10X官網(wǎng)https://support./single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/using/tutorial_in 或者 單細胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 開啟單細胞之旅（上）

1 scRNA分析

首先下載refdata文件,，然后解壓

wget https://cf./supp/cell-exp/refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz tar -zxvf refdata-gex-GRCh38-2020-A.tar.gz

進行cellranger count分析

/path/cellranger count --id=sample1 \                   --transcriptome=/path/.../refdata-gex-GRCh38-2020-A \                   --fastqs=/path/.../fastq_path \                   --sample=sample1 \                   --expect-cells=1000 \

運行結果在outs文件夾,，建議每個文件都在官網(wǎng)中查一下大概的含義,，這里重點關注outs/filtered_feature_bc_matrix文件夾,， 單細胞工具箱|Cell Ranger-V6.0 開啟單細胞之旅（上）

2 scVDJ分析

首先下載V(D)J reference文件,，然后解壓

curl -O https://cf./supp/cell-vdj/refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0.tar.gz tar -xf refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0.tar.gz

進行cellranger vdj分析

/path/cellranger vdj --id=sample1 \      --reference=/path/.../refdata-cellranger-vdj-GRCh38-alts-ensembl-5.0.0 \      --fastqs=/path/.../data \ #fastq文件所在路徑      --sample=sample1 \ #第一個下劃線之前的樣本信息      --localcores=8 \      --localmem=64 \

運行結果在outs文件夾，文件很多,，建議根據(jù)https://support./single-cell-vdj/software/pipelines/latest/output/overview了解以下每個文件的意義,。outs/filtered_contig_annotations.csv文件，更需要重點了解每一列的意義,。

以上,，得到每個樣本的單細胞RNA和TCR的結果后就可以使用scRepertoire 或者STARTRAC 進行免疫組庫以及T細胞動態(tài)等分析了。

這些分析后續(xù)會進行系統(tǒng)的介紹,。

參考資料：Single Cell Immune Profiling - Official 10x Genomics Support

精心整理（含圖PLUS版）|R語言生信分析，可視化（R統(tǒng)計,，ggplot2繪圖,，生信圖形可視化匯總）