1、揭示了不同胃癌患者癌細(xì)胞基因表達(dá)異常的共性規(guī)律

該研究篩選出了334個(gè)在14例胃癌患者的癌細(xì)胞中普遍上調(diào)的基因以及82個(gè)普遍下調(diào)的基因,。通過(guò)與癌旁正常胃上皮細(xì)胞以及結(jié)直腸癌癌旁正常腸上皮細(xì)胞的系統(tǒng)比較,，發(fā)現(xiàn)胃癌異常上調(diào)基因中有26個(gè)是腸上皮細(xì)胞特異高表達(dá)的基因，例如TFF3,、CLDN3,、CLDN4、CLDN7,、TMEM176A,、TMEM176B和MUC13等。這不僅發(fā)生在腸型胃癌中,，也發(fā)生在彌漫型以及混合型胃癌中,。

同時(shí)，一些正常胃上皮細(xì)胞特異性表達(dá)并參與行使胃正常生理功能的基因在胃癌細(xì)胞中普遍顯著下調(diào),，例如PGA3,、 PGA5、PGC,、LIPF,、GKN1、GKN2,、MUC1,、MUC5AC和MUC6等。這說(shuō)明胃癌的腫瘤發(fā)生過(guò)程中上皮細(xì)胞發(fā)生去分化,，失去部分正常胃上皮的基因表達(dá)特征和正常生理功能,，同時(shí)由于這些癌細(xì)胞的可塑性增加，因而異常表達(dá)了數(shù)十個(gè)腸上皮高表達(dá)的基因,。因?yàn)樵谡０l(fā)育過(guò)程中,，胃上皮和腸上皮來(lái)自共同的消化道上皮前體細(xì)胞，胃癌細(xì)胞異常表達(dá)部分腸上皮特異性基因說(shuō)明胃癌細(xì)胞失去部分分化特征的同時(shí)獲得了很強(qiáng)的可塑性,，這對(duì)理解胃癌易復(fù)發(fā),、易耐藥的特征提供了新的研究視角。

圖2. 26個(gè)正常結(jié)腸上皮高表達(dá)并在胃癌細(xì)胞中上調(diào)的基因,。NAT,，胃癌癌旁正常上皮細(xì)胞

通過(guò)聯(lián)合單細(xì)胞表觀組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性和DNA甲基化水平的異常改變可能解釋部分基因在胃癌細(xì)胞中表達(dá)量的異常改變,，為理解胃癌發(fā)生過(guò)程中基因表達(dá)異常的表觀遺傳學(xué)調(diào)控提供了重要線索,。

圖3. 代表性基因的表達(dá)水平與啟動(dòng)子DNA甲基化和啟動(dòng)子染色質(zhì)可及性

2、系統(tǒng)繪制了胃癌的單細(xì)胞DNA甲基化圖譜

該研究系統(tǒng)繪制了胃癌單細(xì)胞DNA甲基化圖譜,，確認(rèn)了胃癌在腫瘤發(fā)生過(guò)程中癌細(xì)胞經(jīng)歷了全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化,，特別是在重復(fù)元件LINE、SINE,、LTR和Satellite等基因組區(qū)域DNA去甲基化幅度更大,，并且在不同患者間和同一患者內(nèi)均具有強(qiáng)烈異質(zhì)性。相比于結(jié)直腸癌，胃癌的基因組去甲基化幅度更大,。其中,，胃癌細(xì)胞基因組中LINE-1 的DNA甲基化水平強(qiáng)烈下降，同時(shí)LINE-1編碼的 ORF1p蛋白異常上調(diào)表達(dá),，提示部分逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子LINE-1很可能在胃癌細(xì)胞中被異常激活轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座,，進(jìn)而破壞基因組完整性。

圖4. 多個(gè)胃癌患者共有的胃癌細(xì)胞中異常甲基化的基因（啟動(dòng)子區(qū)域）

該研究鑒定了多個(gè)患者間共有的胃癌細(xì)胞特異高甲基化或特異性低甲基化的基因（啟動(dòng)子區(qū)域）,，這些基因可作為候選的胃癌DNA甲基化標(biāo)志物,，例如異常高甲基化的TMEM240和HAGLROS基因的啟動(dòng)子區(qū)域，以及異常低甲基化的TRPM2-AS和HRH1基因的啟動(dòng)子區(qū)域,。這一發(fā)現(xiàn)有望為胃癌的臨床診斷提供理論依據(jù),。

3、揭示了混合型胃癌癌細(xì)胞遺傳克隆,、DNA甲基化亞群以及轉(zhuǎn)錄組亞群之間的復(fù)雜交互關(guān)系

鑒于混合型胃癌的腫瘤異質(zhì)性極強(qiáng),，該研究采取多點(diǎn)取樣以及單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序方案為探究混合型胃癌的癌細(xì)胞的空間位置、遺傳克隆,、DNA甲基化亞群以及基因表達(dá)亞的交互關(guān)系提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ),。首先，通過(guò)染色體拷貝數(shù)變異模式準(zhǔn)確鑒定了同一個(gè)患者體內(nèi)的癌細(xì)胞的遺傳譜系,，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化亞群與遺傳克隆高度吻合,，在同一個(gè)患者體內(nèi)同一個(gè)遺傳克隆內(nèi)的不同癌細(xì)胞的DNA甲基化水平相似，而不同遺傳克隆癌細(xì)胞的DNA甲基化水平常常差異很大,。這說(shuō)明全基因組去甲基化在胃癌遺傳克隆形成的時(shí)候已經(jīng)基本確立,，而在后續(xù)的克隆擴(kuò)張過(guò)程中可維持相對(duì)穩(wěn)定。

圖5. DNA甲基化的層次聚類分群與遺傳克隆一致

然而,，同一個(gè)胃癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的遺傳克隆或者DNA甲基化亞群與轉(zhuǎn)錄組亞群之間并非簡(jiǎn)單的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,，同一個(gè)遺傳克隆的癌細(xì)胞可以對(duì)應(yīng)多個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞群，不同遺傳克隆的癌細(xì)胞也可以對(duì)應(yīng)同一個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞群,。此外,，混合型胃癌呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的空間異質(zhì)性，不僅同一患者不同取樣位置包含的癌細(xì)胞遺傳克隆,、DNA甲基化亞群和轉(zhuǎn)錄組亞群可以存在差異,，同一取樣位置內(nèi)部也可以含有多個(gè)不同的遺傳克隆、DNA甲基化亞群或轉(zhuǎn)錄組亞群,。

圖6. 遺傳譜系,、轉(zhuǎn)錄組亞群和取樣位置的對(duì)應(yīng)情況

4、聯(lián)合單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)分析,、多點(diǎn)取樣及點(diǎn)對(duì)點(diǎn)組織病理學(xué)分析精準(zhǔn)鑒定混合型胃癌不同分化狀態(tài)癌細(xì)胞的多個(gè)組學(xué)層面的關(guān)鍵分子特征及免疫微環(huán)境特點(diǎn)

該研究通過(guò)分析不同胃癌轉(zhuǎn)錄組亞群的特征基因,，鑒定出了每個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞群癌細(xì)胞的分化狀態(tài),，包括腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌,，并且與同一采樣位點(diǎn)的病理分析結(jié)果基本吻合,。此外，將腺癌進(jìn)一步細(xì)分為不同的分化程度（高分化,、中分化和低分化）是一件頗具挑戰(zhàn)性的工作,，主要原因包括：

1）由于胃癌患者間異質(zhì)性強(qiáng)烈,，目前仍缺乏已知,、通用的可用于鑒定腺癌內(nèi)部不同分化程度腫瘤的標(biāo)志基因；

2) 盡管每個(gè)取樣部位的病理分析結(jié)果可以提供有力證據(jù),，但同一個(gè)取樣部位內(nèi)部依然可能存在空間異質(zhì)性,。

針對(duì)這一問(wèn)題，該研究充分發(fā)揮多點(diǎn)取樣,、同一采樣位點(diǎn)病理分析及單細(xì)胞多組學(xué)數(shù)據(jù)分析的聯(lián)合優(yōu)勢(shì),，在UMAP分群受患者間異質(zhì)性影響較大的情況下，采用PCA的PC3軸將每個(gè)混合型胃癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的不同分化狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄組亞群區(qū)分開(kāi),，包括區(qū)分腺癌內(nèi)部不同的分化程度（高分化,、中分化和低分化），并與同一采樣位點(diǎn)的病理分析結(jié)果基本吻合,。

圖7. 對(duì)混合型胃癌患者單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的PCA降維結(jié)果

在準(zhǔn)確鑒定癌細(xì)胞不同分化狀態(tài)的基礎(chǔ)上,，該研究進(jìn)一步探究了不同分化狀態(tài)癌細(xì)胞的分子特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn),，粘蛋白家族成員MUC1在中分化和高分化腺癌中高表達(dá),，在每個(gè)患者體內(nèi)隨著分化狀態(tài)變差其表達(dá)量顯著降低。纖連蛋白FN1在分化狀態(tài)較差（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）的癌細(xì)胞中表達(dá)量顯著升高,。并且,，基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)可及性和DNA甲基化的改變可以部分解釋部分基因在不同分化狀態(tài)間表達(dá)水平的差異。

此外,，盡管胃癌分化狀態(tài)的特征基因在患者間表現(xiàn)出強(qiáng)烈異質(zhì)性,，卻可以匯聚到一些共性的信號(hào)通路上。例如,，每個(gè)患者體內(nèi)分化狀態(tài)較差的癌細(xì)胞上調(diào)的基因富集在細(xì)胞周期,、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)通路，而每個(gè)患者體內(nèi)分化狀態(tài)較好的癌細(xì)胞上調(diào)的基因富集在免疫相關(guān)通路,。

圖8. MUC1和FN1蛋白的免疫組化結(jié)果,。ADC，腺癌,；NEC,，神經(jīng)內(nèi)分泌癌；HAS，肝樣胃癌,。

該研究發(fā)現(xiàn),，對(duì)于多數(shù)混合型胃癌患者（5/6）的原發(fā)灶癌細(xì)胞，分化狀態(tài)較差的癌細(xì)胞的全基因組DNA甲基化水平顯著高于分化狀態(tài)較好的癌細(xì)胞,，但仍低于正常胃上皮細(xì)胞,。該結(jié)果提示胃癌在腫瘤發(fā)生早期發(fā)生的大規(guī)模全基因組去甲基化使得以LINE-1為代表的重復(fù)序列被異常轉(zhuǎn)錄，激活了胃癌細(xì)胞作為上皮細(xì)胞的抗原遞呈特性,，使得免疫細(xì)胞可以識(shí)別這些癌細(xì)胞,。而在這些癌細(xì)胞進(jìn)一步去分化或者轉(zhuǎn)分化（變成神經(jīng)內(nèi)分泌癌或者肝樣胃癌）過(guò)程中其全基因組甲基化水平部分回調(diào)，可能部分抑制了重復(fù)序列的異常轉(zhuǎn)錄,，降低了癌細(xì)胞的抗原遞呈特性,，從而使得免疫細(xì)胞更難識(shí)別和攻擊這些低分化或者轉(zhuǎn)分化的癌細(xì)胞。

圖9. 每個(gè)胃癌患者體內(nèi)不同分化狀態(tài)的原發(fā)灶癌細(xì)胞的全基因組DNA甲基化水平

通過(guò)在同時(shí)含有腺癌和非腺癌的混合型胃癌內(nèi)部進(jìn)行比較,，發(fā)現(xiàn)非腺癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）內(nèi)部的CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)水平較低,，CD8+ T細(xì)胞主要存在于腫瘤邊緣，呈現(xiàn)出免疫排斥型的免疫微環(huán)境特征,。相反,，腺癌內(nèi)部的CD8+ T細(xì)胞浸潤(rùn)水平相對(duì)較高。相應(yīng)地,，腺癌部分的免疫相關(guān)通路評(píng)分也顯著高于非腺癌（神經(jīng)內(nèi)分泌癌和肝樣胃癌）部分,。

圖10. 一例代表性的混合性腺神經(jīng)內(nèi)分泌癌的CD8免疫組化結(jié)果

總之，該研究通過(guò)對(duì)胃癌根治手術(shù)標(biāo)本中配對(duì)的癌旁,、原發(fā)灶,、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行系統(tǒng)性多點(diǎn)采樣和單細(xì)胞多組學(xué)（基因組、DNA甲基化組,、染色質(zhì)狀態(tài)組以及轉(zhuǎn)錄組）測(cè)序分析,，揭示了不同胃癌患者癌細(xì)胞基因表達(dá)異常的共性規(guī)律，發(fā)現(xiàn)不同分型的胃癌都普遍高表達(dá)腸上皮細(xì)胞特異性基因,，這反映了胃癌細(xì)胞在失去正常生理功能的去分化過(guò)程中其可塑性也普遍增加,。系統(tǒng)繪制了胃癌的單細(xì)胞DNA甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)胃癌與結(jié)直腸癌類似,，在腫瘤發(fā)生過(guò)程中其癌細(xì)胞經(jīng)歷了全基因組范圍的大規(guī)模DNA去甲基化,，同時(shí)少量基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生DNA甲基化異常上調(diào)；發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌類似,，在同一胃癌中同一個(gè)遺傳克隆內(nèi)的不同癌細(xì)胞的DNA甲基化水平相似,，而不同遺傳克隆癌細(xì)胞的DNA甲基化水平常常差異很大。這說(shuō)明全基因組DNA去甲基化在胃癌腫瘤發(fā)生相對(duì)早期的階段就完成了,，并在此后每個(gè)遺傳克隆的擴(kuò)張過(guò)程中基本維持不變,。發(fā)現(xiàn)同一胃癌中癌細(xì)胞的遺傳克隆或者DNA甲基化亞群與轉(zhuǎn)錄組亞群之間并非簡(jiǎn)單的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系,，同一個(gè)遺傳克隆的癌細(xì)胞可以對(duì)應(yīng)多個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞群，不同遺傳克隆的癌細(xì)胞也可以對(duì)應(yīng)同一個(gè)轉(zhuǎn)錄組亞群,；發(fā)現(xiàn)在混合型胃癌中,，相比于分化狀態(tài)較好的癌細(xì)胞，分化狀態(tài)較差（例如神經(jīng)內(nèi)分泌癌,、肝樣胃癌）的癌細(xì)胞部分回調(diào)全基因組甲基化,，上調(diào)細(xì)胞周期、應(yīng)激反應(yīng)等相關(guān)通路基因,，下調(diào)免疫相關(guān)通路基因,，免疫浸潤(rùn)水平較低。