來源：科學網(wǎng) 孫學軍 的博客

癌癥從根本上說是一種遺傳疾病。改善其治療需要更深入地了解個體基因突變以及它們?nèi)绾斡绊懠膊∵M展,。然而，對癌癥的復雜基礎進行建模并非易事,。 Francisco J. Sánchez-Rivera在麻省理工學院（MIT）運營著一個致力于這一挑戰(zhàn)的實驗室,，使用精確的基因組編輯來產(chǎn)生單核苷酸突變，然后研究它們對癌癥發(fā)展的影響,。該實驗室的精確方法通過復雜的“傳感器序列”來實現(xiàn),，這些“傳感器序列”可以監(jiān)控編輯效率，包括評估堿基編輯器是否導致了任何不需要的突變,。Sánchez-Rivera 及其同事與安捷倫科技公司合作,，使用 SurePrint 高保真寡核苷酸文庫合成 （HiFi OLS） 平臺開發(fā)了足夠可靠的傳感器。

這位癌癥生物學家Francisco J. Sánchez-Rivera解釋了安捷倫為各個領域的實驗室開發(fā)的 HiFi 寡核苷酸合成技術(shù)如何幫助他的團隊突破癌癥研究的界限,。

Precision genome editing puts cancer mutations under the spotlight () [精確的基因組編輯將癌癥突變置于聚光燈下()]

問：為什么要在特定突變水平上研究癌癥,？

每個基因都可以以數(shù)百甚至數(shù)千種方式發(fā)生突變，每個突變都可以產(chǎn)生自己的生物學效應,。我們需要知道所有這些突變是如何單獨發(fā)揮作用的,，以了解癌癥是如何發(fā)展和進展的?；贑RISPR的技術(shù)可以滅活或改變整個基因的表達,，可以識別癌癥的治療靶點和生物過程,。但他們沒有模擬腫瘤中觀察到的特定突變的影響，這些突變在癌癥患者中可能會有很大差異,。

問：您的實驗方法是什么？

我們使用稱為堿基編輯器的基于CRISPR的工具在基因序列中產(chǎn)生精確的單核苷酸變化,。CRISPR Cas9切口酶蛋白產(chǎn)生單鏈DNA切口,，然后物理連接到Cas9的堿基轉(zhuǎn)換酶產(chǎn)生胞嘧啶到胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)換。我們通常使用病毒載體提供堿基編輯器,，然后研究它們在細胞系或?qū)嶒炇倚∈笾械淖饔?。例如，我們可以確定給定的突變是否影響癌細胞增殖,，或者它是否促進轉(zhuǎn)移或耐藥性,。

問：您如何確定堿基編輯器引入了正確的突變？

這可能是一個棘手的問題：您不希望基本編輯器無意中改變其他附近的序列,。我們解決這個問題的方法是將我們所謂的“傳感器序列”嵌入病毒載體骨架中,。該傳感器包括與內(nèi)源性靶位點的合成版本偶聯(lián)的引導RNA。合成和內(nèi)源性DNA序列同時發(fā)生突變,。通過對傳感器進行測序,，我們可以確定給定堿基編輯器進行內(nèi)源性變化的精度。

問：高保真寡核苷酸合成如何使這項研究成為可能,？

在初步研究中,，我們發(fā)現(xiàn)近一半的傳感器在合成過程中出現(xiàn)了錯誤。由于我們的傳感器設計方式以及長度,，我們需要獲得盡可能高保真度的寡核苷酸合成,。幸運的是，我們能夠利用安捷倫的 SurePrint HiFi OLS 平臺,。在它商業(yè)化之前,，我們是beta測試人員，這確實是我們合成傳感器結(jié)構(gòu)的唯一方法,。這些類型的傳感器現(xiàn)在代表了我們實驗室武器庫的核心支柱,。

問：您做了哪些工作來驗證這種方法？

我們最近用它來研究人類腫瘤中發(fā)現(xiàn)的數(shù)千個突變,，這些突變是由紐約紀念斯隆凱特琳癌癥中心的研究人員收集的,。我們表明，傳感器編輯準確地報告了相應內(nèi)源位點的編輯,。

問：您的方法是否導致了癌癥生物學的發(fā)現(xiàn),？

在獲得這一驗證后，我們開發(fā)了用于在p53腫瘤抑制基因中產(chǎn)生靶向突變的指導RNA組合,。超過一半的癌癥具有p53突變,，阻止其激活抗腫瘤基因,。我們確定了以前從未研究過的五個突變，并將它們引入含有p53基因野生型拷貝的胰腺上皮細胞中,。當我們將這些編輯過的細胞植入小鼠體內(nèi)時,，所有動物都患上了胰腺腫瘤。根據(jù)我們的實驗,，我們現(xiàn)在也知道不同的突變會產(chǎn)生體內(nèi)具有不同攻擊性的腫瘤,。這些研究表明，并非所有突變都是相同的,，我們需要了解它們中的每一個如何驅(qū)動患者的不同生物學,。

問：您的研究如何提高對癌癥的理解和治療？

如果我們能夠通過腫瘤中的突變對患者進行功能分層,，那么我們可以更好地理解和研究個體突變?nèi)绾胃淖儗χ委煹姆磻?nbsp;- 例如,，包括可能針對突變p53的治療。我們目前正在開發(fā)更精確的基于細胞的小鼠模型,，以密切模仿患者的癌癥生物學,。

問：您的實驗室下一步是什么？

我們的研究表明,，使用SurePrint HiFi寡核苷酸文庫可以同時詢問數(shù)千個遺傳變異,。但是通過堿基編輯，我們只能設計過渡突變,，例如胸腺嘧啶取代胞嘧啶,。因此，我們錯過了癌癥患者中大約一半的突變,。我們已經(jīng)開始采用更新的“主要編輯”技術(shù),，使我們能夠系統(tǒng)地設計給定基因中所有可能的突變，到目前為止,，結(jié)果非常驚人,。這些方法將幫助我們定義控制復雜遺傳相互作用的所有機制，這將影響生物學和醫(yī)學的所有領域