圖1 研究流程圖

1. ES中DEG的識別及功能富集分析

在對微陣列結(jié)果進行標準化后,，發(fā)現(xiàn)了DEG（GSE45544中有595個，GSE17618中有3343個）,。根據(jù)維恩圖,，兩個數(shù)據(jù)集的重疊部分包括187個基因（圖2A）。在尤文肉瘤組織和非癌組織的比較中,，有56個下調(diào)基因和131個上調(diào)基因。根據(jù)對KEGG通路的分析,，DEG在細胞周期和金黃色葡萄球菌感染中顯著豐富（圖2B）,。根據(jù)GO分析，DEG中BP的改變主要集中在細胞分裂,、細胞增殖,、細胞粘附、有絲分裂核分裂,、細胞凋亡的正調(diào)節(jié)過程和藥物反應（圖2C）,。ATP結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合,、染色質(zhì)結(jié)合和蛋白激酶結(jié)合在DEG的MF中得到了顯著豐富（圖2D）,。DEGs的CC改變主要富集在紡錘體極、膜,、細胞質(zhì),、粘著斑、細胞質(zhì),、核質(zhì),、細胞外外泌體和細胞核中（圖2E）。

圖2 ES中DEG的識別及功能富集分析

2. PPI網(wǎng)絡(luò)和模塊的構(gòu)建與分析

使用Cytoscape插件工具MCODE以建立DEG-PPI網(wǎng)絡(luò)最有意義的模塊,。PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3A）包括149個節(jié)點和1246條邊,，其中36個基因下調(diào)和113個基因上調(diào)，而MCODE網(wǎng)絡(luò)（圖3B）由43個節(jié)點和857條邊組成,。此外,，通過ClueGO（圖3C）可視化了MCODE-DEGs的生物過程分析,，它集中于細胞周期蛋白依賴性蛋白的調(diào)節(jié)、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性,、胞質(zhì)分裂,、核染色體分離、有絲分裂中期/后期轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié),和主軸組織,。此外,，分層聚類發(fā)現(xiàn)，根據(jù)訓練集的表達譜,，最重要模塊的基因表達水平顯著區(qū)分了ES樣本和非腫瘤樣本（圖3D）,。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

3. Core-DEG選擇與評估

前15個關(guān)鍵基因，包括CCNB2,、CCT2,、CD44、ECT2,、FOXM1,、HLA-DPA1、ITGA6,、KIF20A,、LYZ、MKI67,、PLK1,、RFC4、TGFBR2,、TYMS和UBE2T,，在Cytoscape插件構(gòu)建了一個關(guān)鍵基因的交互網(wǎng)絡(luò)，產(chǎn)生了15個節(jié)點和43個邊（圖4A）,。然后,，利用ClueGO軟件研究關(guān)鍵基因的生物學過程，主要集中在有絲分裂胞質(zhì)分裂,、dTMP生物學過程和自身抗原耐受誘導的正調(diào)控,；這些數(shù)據(jù)表明，關(guān)鍵基因在調(diào)節(jié)細胞周期和內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用（圖4B）,。此外,，關(guān)鍵基因的突變生存分析是在cBioPortal中使用Kaplan-Meier方法在線完成的。在15個關(guān)鍵基因中,，只有UBE2T的生存分析有和沒有改變的對數(shù)秩檢驗表明具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）,，UBE2T改變顯示總體和無病生存率顯著降低（圖4C），并且有較差的結(jié)果。這些數(shù)據(jù)表明UBE2T可能是ES進展中的重要生物標志物,。因此,，UBE2T被定義為“core-DEG”，稍后將對其進行研究,。

圖4 核心基因的鑒定與評估

4. UBE2T和CD99在驗證數(shù)據(jù)集和ES樣本IHC中的表達變化

使用GSE68776驗證了core-DEG的表達,。火山圖顯示發(fā)現(xiàn)了15,440個DEG（上調(diào)=939,，下調(diào)=6,435）,。UBE2T在驗證數(shù)據(jù)集中顯著上調(diào)（圖4D）。此外,，IHC用于鑒定UBE2T蛋白在尤文氏肉瘤和正常組織中的表達,。研究結(jié)果表明，UBE2T蛋白在ES中過表達,，但在正常組織中未過表達（圖4E）,。各組之間存在統(tǒng)計學顯著差異（圖4F）。顯然,，研究數(shù)據(jù)支持了作者的預測,。此外，CD99在ES組織的IHC中具有較高的特異性診斷價值,，因此有必要觀察ES樣本與對照組之間的差異,。IHC結(jié)果顯示CD99在ES組織的細胞膜上呈彌漫性陽性（圖4G、H）,。

5. UBE2T在ES訓練集和驗證集的診斷性能

圖5描述了UBE2T在ES中的診斷價值。與對照組相比,，UBE2T在訓練集（GES17618和GSE45544）的ES中顯著過表達（圖5A）,。UBE2T診斷ES的ROC曲線下面積(AUC)為0.75，靈敏度和特異性分別為0.85和0.62（圖5B,、C）,。有趣的是，核心基因在驗證集（GSE68776）中對ES的診斷評價也很出色,。UBE2T表達在ES中顯著增加（圖5D）,。ROC的AUC為0.90，靈敏度為0.94,，特異性為0.79（圖5E,、F）。顯然,，這些發(fā)現(xiàn)表明UBE2T對ES診斷具有極好的價值,。

圖5 UBE2T在ES訓練集和驗證集的診斷性能

6. 聚類分析

根據(jù)MCODE模塊基因的表達水平，將55個帶有患者的ES樣本分為4個亞組：C1（N=17）,、C3（N=12）,、C4（N=13）)和C2(N=13)(圖6A),。在k=2到k=10個簇中，K=2的一致性最高,，k=4次之（圖6B）,。UMAP分析表明集群之間存在顯著差異（圖6C）。此外,，熱圖顯示MCODE-DEG的表達模式在四個亞組之間存在差異（圖6D）,。Kaplan-Meier生存分析顯示亞組之間存在顯著差異（圖6E），尤其是C3和C4,，而C3的ES患者比C4患者的疾病發(fā)展更快,。并且，C3中34個基因的表達水平與C4相比顯著升高（圖6F）,。

圖6 聚類分析

7. UBE2T高表達與ES患者預后不良的相關(guān)性分析

基于訓練集,，進行單因素Cox回歸分析以研究核心DEGs在ES中的預后風險，結(jié)果表明UBE2T是一個獨立的危險因素（圖7A),。此外,，KaplanMeier生存曲線證明了UBE2T表達與生存之間的聯(lián)系。UBE2T高表達患者的總生存時間明顯短于UBE2T低表達患者（圖7B）,。此外,，C3中UBE2T明顯高于C4（圖7C），存活時間明顯短于C4（圖7D）,。這些結(jié)果表明UBE2T表達的上調(diào)與ES患者的較差結(jié)果相關(guān),。此外，風險評分和生存時間研究顯示,，高風險評分組患者的生存時間明顯低于低風險組（圖7E）,。研究結(jié)果表明，高風險評分組導致疾病快速進展,。圖7F描述了各種風險評分,、生存事件和基因表達變化之間的關(guān)聯(lián)?？梢钥闯?，當UBE2T表達上調(diào)（圖7F）和風險評分增加（圖7F）時，患者的存活率急劇下降（圖7F）,。正如預測的那樣,，UBE2T被視為一個風險獨立因素，風險評分隨著其表達的增加而增加,。

圖7 訓練隊列ES患者UBE2T表達與預后的相關(guān)性分析

總結(jié)

綜上所述,，目前的檢查發(fā)現(xiàn)UBE2T在ES患者腫瘤組織中的表達高于非腫瘤組織，UBE2T作為ES診斷的生物標志物具有重要價值。此外,，增加的UBE2T表達與較差的預后相關(guān),。因此，UBE2T可用作ES患者的獨立預后生物標志物,。對腫瘤感興趣的老師,，歡迎掃碼咨詢！