神經(jīng)退行性疾病是影響全球數(shù)百萬人的高度致殘且最終致命的疾病,，主要包括肌萎縮側索硬化癥 (Amyotrophic lateral sclerosis, ALS),、帕金森病 (Parkinson's disease, PD)、阿爾茨海默癥 (Alzheimer's disease, AD) 和亨廷頓病  (Huntington's disease, HD),。在神經(jīng)退行性疾病中,，特定的神經(jīng)元亞群，例如多巴胺能和膽堿能神經(jīng)元或運動神經(jīng)元會逐漸退化,，導致特定模式的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙,。傳統(tǒng)藥物治療用于延緩疾病進展，不能使功能修復或組織再生^[1],。

神經(jīng)干細胞 (Neural stem cells, NSCs) 在神經(jīng)系統(tǒng)的可塑性,、衰老、疾病和再生方面具有重要作用,。基于體內(nèi)移植的 NSCs 具有自我更新,、增殖、多向分化,、低免疫原性和遷移的特點,，NSCs 移植的成為了極具前景的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病療法，為腦損傷修復以及神經(jīng)性疾病的治療帶來了希望,。

 關于神經(jīng)干細胞及其分化 

神經(jīng)干細胞 (NSCs) 被喻為中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 的 “種子” 細胞,，不同神經(jīng)細胞系的產(chǎn)生起源于成體神經(jīng)干細胞。神經(jīng)干細胞命運的調(diào)控更是一個精細的過程,，依賴于從表觀遺傳延伸到翻譯水平的復雜調(diào)控網(wǎng)絡,，且涉及細胞外基質(zhì)成分^[2]。

成體 NSCs 可以自我更新或響應特定刺激分化為神經(jīng)元,、星形膠質(zhì)細胞或少突膠質(zhì)細胞 (圖 1),，不同譜系的神經(jīng)細胞功能各異。

圖 1. NSCs 分化途徑以及譜系特異性標志^[3]

神經(jīng)元 (Neurons) 是神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能的基本單位,，通過軸突和樹突傳遞信號,。典型的神經(jīng)元由樹突、細胞體,、軸突 (包括軸突丘) 和突觸前末端組成,。神經(jīng)元自身不能再生。移植外源性 NSCs 或動員內(nèi)源性 NSCs,，使其分化為神經(jīng)元,，重建損傷的神經(jīng)回路，是一種被廣泛探索的治療神經(jīng)退行性疾病的方法,。  

星形膠質(zhì)細胞 (Astrocytes) 是中樞神經(jīng)系統(tǒng) (CNS) 中最豐富的細胞類型,，它們與神經(jīng)元,、少突膠質(zhì)細胞和內(nèi)皮細胞交流，并在結構上支持它們生長,，整合為三聯(lián)突觸和神經(jīng)血管單位,，履行其功能。除了參與細胞通訊外,，星形膠質(zhì)細胞還能通過釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子,，如膠質(zhì)細胞系衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF)，以及降低神經(jīng)元的興奮中毒,，發(fā)揮神經(jīng)保護作用,。

少突膠質(zhì)細胞 (Oligodendrocytes, OLGs) 是有髓鞘的膠質(zhì)細胞，對神經(jīng)元電絕緣,、促進跳躍信號傳導非常重要,。少突膠質(zhì)細胞還通過髓磷脂膜為神經(jīng)元軸突提供代謝和營養(yǎng)支持，包括乳酸,、丙酮酸和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 等神經(jīng)營養(yǎng)因子,。

 神經(jīng)干細胞，該如何培養(yǎng),？

 可以通過三種不同的方法獲得 NSCs (圖 2)：(1) 從原發(fā)性 CNS 組織直接提取,，包括腦和脊髓組織；(2) 分化多能干細胞,，例如胚胎干細胞和誘導性多能干細胞,；(3) 轉分化體細胞，如皮膚成纖維細胞和血細胞,。從上述來源產(chǎn)生的 NSCs 可以通過基因改造,，進一步永生化^[1]。圖 2. NSCs 的來源^[1]

如何有效地將 NSCs 誘導成特定的細胞類型? 神經(jīng)營養(yǎng)因子,、生長因子參與了 NSCs 增殖和分化的內(nèi)源性調(diào)控，已被證明能誘導 NSCs 分化,。目前已經(jīng)開發(fā)了不同的 NSCs 分化方案,。大多數(shù)都是基于含有生長因子的培養(yǎng)基，NSCs 在其中粘附和增殖,。這些生長因子包括成纖維細胞生長因子 (FGF) 和/或表皮生長因子 (EGF),、神經(jīng)生長因子 (NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (BDNF) 和膠質(zhì)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子 (GDNF) 等,。

如在下文中,，作者團隊發(fā)表了一種快速、高效的分化方法,，通過使用含有必要生長因子的選擇性培養(yǎng)基從骨髓來源的細胞中生成小鼠 OLGs,。通過該方案,，可以在 7-8 周內(nèi)獲得成熟的 OLGs (與以前的工作相比，獲得 OLGs 的時間更短),。 

作者團隊的方法主要包括三個步驟: 骨髓來源的 NSCs 生成,、NSCs-OPCs 分化和 OLGs 成熟^[4]。 

骨髓來源的 NSCs 生成：收集骨髓組織切小塊,，消化,，將細胞懸浮在無血清 DMEM/F12 中，添加 2% B27 補充劑,， 20 ng/mL EGF 和 10 ng/mL bFGF ,，同時添加 100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素。隨后將細胞懸浮在 NSC-PM (神經(jīng)干細胞增殖培養(yǎng)基)中,，并包裹于含聚 D-賴氨酸和層粘連蛋白的 24 孔板,。10-14 天后，形成類似神經(jīng)球的細胞團簇,。

骨髓來源的 NSCs-OPCs 的分化和增殖：形成的神經(jīng)球被消化到單細胞中,，在 NSC-PM 中培養(yǎng)。每個孔中的神經(jīng)球被消化成單細胞,，在特定的 NSCs 分化培養(yǎng)基中培養(yǎng),。

   星形膠質(zhì)細胞分化時，DMEM 中添加 1% N2,、2 mM GlutaMax-I 和 1% FBS,。OLGs 分化培養(yǎng)基添加 2% B27、2 mM GlutaMax-I 和 20 ng/mL T3 的 neuro 培養(yǎng)基,。2 周后,，分化培養(yǎng)基中的 NSCs 形態(tài)發(fā)生變化，并且能檢測到神經(jīng)元,、星形膠質(zhì)細胞和 OLGs 的標記物,。 

OLGs 成熟：在 OLGs 成熟過程中，用 DPBS 緩沖液洗去生長因子 (PDGF-AA 和 bFGF),，加入新鮮 EOLG-DM (早期 OLGs 分化培養(yǎng)基) 誘導 OLGs 分化,，然后將在EOLG-DM 培養(yǎng)基中生長 4 天的 OPCs 轉移到 LOLG-DM (晚期 OLGs 分化培養(yǎng)基) 中再生長 10 天，并通過添加 cAMP 加速 OLGs 分化的分支生長,。

圖 3. 從小鼠自體骨髓來源的 NSCs 中生成少突細胞祖細胞 (OPCs) 和少突膠質(zhì)細胞^[4]

此外,，越來越多的科研人員關注多種神經(jīng)營養(yǎng)因子/細胞因子聯(lián)合使用。Kyung-Chul Choi 教授團隊證明了生長因子的組合使用 (bFGF+IGF-I,、bFGF+NGF,、bFGF+BDNF、BDNF+IGF-I、bFGF+NGF) 對 NSCs 分化為神經(jīng)元的效果比單個生長因子 (bFGF,、IGF-I,、BDNF 和 NGF) 處理結果更顯著^[5]。

NSCs 移植與阿爾茨海默癥治療  

阿爾茨海默癥 (Alzheimer's disease, AD) 是一種神經(jīng)退行性疾病,，由皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)量顯著減少引起,，其發(fā)展主要與淀粉樣蛋白 (Aβ) 蛋白的積累和 Tau 蛋白的過度纏結相關,。AD 的主要癥狀包括記憶力減退和認知障礙，大部分患者為老年人。AD 不僅降低老年人的生活質(zhì)量,，也加劇老齡化相關的經(jīng)濟負擔,，因此,，AD 的治療是眾多研究者重點關注的課題,。目前治療 AD 的常用藥物有多奈哌齊、卡巴拉汀,、加蘭他敏,、他克林4 種乙酰膽堿酯酶抑制劑，以及 1 種 NMDA 受體拮抗劑美金剛,。但藥物無法再生已損傷或丟失的神經(jīng)元,，對于已有明顯癥狀患者治療效果并不明顯。NSCs 能夠自我更新并分化各種神經(jīng)細胞,，NSCs 移植療法已顯示出治療 AD 的巨大潛力,。移植后，NSCs 分化為神經(jīng)元和/或神經(jīng)膠質(zhì)細胞并釋放營養(yǎng)因子,，從而修復 AD 引起的認知障礙 (圖 4),。然而，盡管 NSCs 移植能再生神經(jīng)元,，但對已產(chǎn)生的 Aβ 卻無法有效清除,，這對移植后 NSCs 的存活也有不利的影響。對于 NSCs 的改造也是一個新興的研究課題,。

圖 4. NSCs 移植途徑及認知障礙修復機制：觸發(fā)內(nèi)源性突觸形成,、內(nèi)源性神經(jīng)形成影響行為表現(xiàn)、調(diào)節(jié) Aβ 聚集^[6]

接下來小 M 來介紹一個在 APPswe/PS1dE9 雙轉基因小鼠中移植 NSCs 治療 AD 的例子~ 蘇州納米所王強斌團隊開發(fā)了一種能夠穩(wěn)定和持續(xù)表達腦啡肽酶 (NEP) 的基因工程 NSCs,。NSCs 經(jīng)改造后,，在細胞膜上表達的 NEP 和釋放的胞外載體可持續(xù)降解 Aβ，提高 NSCs 和內(nèi)源性神經(jīng)細胞的存活率,。PPAR-siSOX9 納米制劑可通過協(xié)同調(diào)節(jié) Wnt/β-catenin 和 RA 信號通路來提高 NEP-NSC 的分化效率。研究者們將改造的 PPAR-siSOX9 納米制劑-NEP-NSCs 立體定向移植到 APPswe/PS1dE9 雙轉基因 AD 小鼠模型的海馬體中(海馬體是大腦中最容易受到 AD 病理學損傷形成的區(qū)域),。與對照組相比,，經(jīng)過治療后的 AD 小鼠具有更高活力和更高密度的神經(jīng)元，并且具有更高的存活率,。治療一個月后,，大腦中的病理性 Aβ 聚集的斑塊面積和大小也顯著降低 (圖 5),。在 Morris 水迷宮實驗中證明，納米制劑-NEP-NSCs 治療小鼠更頻繁地穿過平臺并在目標象限中游泳的時間更長,。這些結果表明,，經(jīng)改造后的納米制劑-NEP-NSCs 在 AD 小鼠模型中能更有效地降解 Aβ 以及再生神經(jīng)元，逆轉了小鼠記憶與學習缺陷,。 

圖 5. NSCs 移植治療后 AD 小鼠大腦中 Aβ 定量檢測,。G1：健康小鼠；G2：PBS 處理組,；G3：NSC 治療組,；G4：納米制劑-NSC 治療組；G5：NEP–NSC 治療組,；G6：納米制劑-NEP-NSC 治療組^[7]

  除了阿爾茨海默癥,，在其他疾病如帕金森病 (PD)、肌萎縮側索硬化癥 (ALS),、亨廷頓病 (HD),、中風、創(chuàng)傷性腦損傷 (TBI) 等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療中,，NSCs 移植也表現(xiàn)出巨大的潛力,。表 1. 通過神經(jīng)干細胞移植治療神經(jīng)疾病動物模型 (部分參考) ^[1]

PMID (從上至下): 

17038899, 27213850, 25022790, 18683244, 27562609, 25132189

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參考文獻

1. Yuewen Tang, L Cheng, et al. Current progress in the derivation and therapeutic application of neural stem cells. Cell Death Dis. 2017 Oct 12;8(10):e3108. 

2. Yanjing Zhu, Ruiqi Huang, Liming Cheng, Rongrong Zhu, et al. Deep learning-based predictive identification of neural stem cell differentiation.Nat Commun. 2021 May 10;12(1):2614. 

3. Roberta De Gioia, Stefania Corti, et al. Neural Stem Cell Transplantation for Neurodegenerative Diseases. Int J Mol Sci. 2020 Apr 28;21(9):3103. 

4. Yuan Zhang, Xin-Yu Lu, Giacomo Casella, Jing Tian, Xing Li, et al. Generation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Bone Marrow Cells.Front Cell Neurosci. 2019 Jun 5;13:247. 

5. Kyung-Chul Choi,Do-Sung Yoo, et al. Effect of Single Growth Factor and Growth Factor Combinations on Differentiation of Neural Stem Cells. J Korean Neurosurg Soc. 2008 Dec; 44(6): 375-381.

 6. Hayashi Y, Tsai KJ, et al. Effects of neural stem cell transplantation in Alzheimer's disease models. J Biomed Sci. 2020 Jan 27;27(1):29. 

7. Huang D, Wang Q, et al. A Nanoformulation-Mediated Multifunctional Stem Cell Therapy with Improved Beta-Amyloid Clearance and Neural Regeneration for Alzheimer's Disease. Adv Mater. 2021 Apr;33(13):e2006357.