結(jié)直腸癌（CRC）是僅次于肺癌的第二大全球癌癥死亡原因[1]。近年來(lái),，結(jié)腸鏡檢查率的提高促進(jìn)了結(jié)直腸癌的早期發(fā)現(xiàn),，提高了結(jié)直腸癌患者生存率[2]。然而,，有20%的CRC患者在診斷時(shí)已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移,，這部分患者的5年總生存率僅為10.5%[3-4]。此外,，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICB）在絕大多數(shù)CRC患者中無(wú)效[5],。

最近的研究表明，許多CRC的腫瘤微環(huán)境（TME）具有免疫抑制作用,。TME中缺氧,、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、代謝廢物濃度很高,，可導(dǎo)致免疫細(xì)胞功能失調(diào)。同時(shí),，由于腸道菌群產(chǎn)生特定的代謝產(chǎn)物,，原發(fā)性CRC的代謝失調(diào)也受腸道微生物的影響。

宿主和腸道微生物代謝均可產(chǎn)生大量的氨,，由于氨對(duì)許多細(xì)胞有毒性,，正常情況下，代謝產(chǎn)生的氨被肝臟處理后通過(guò)尿素循環(huán)排出體外,。值得注意的是,，一些癌細(xì)胞可以通過(guò)吸收氨驅(qū)動(dòng)氨基酸代謝，但是細(xì)胞外氨在TME中的作用尚不明確[6],。

近日密歇根大學(xué)的Yatrik M Shah教授團(tuán)隊(duì)在Cell Metabolism發(fā)表重要研究成果,，他們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸腫瘤微環(huán)境中有大量氨的積聚，并通過(guò)抑制T細(xì)胞功能來(lái)降低免疫反應(yīng),。去除微環(huán)境中的氨可以重新激活T細(xì)胞,，抑制腫瘤增長(zhǎng)，并使增加腫瘤對(duì)免疫治療的敏感性[7]。

文章封面

ICB治療最近在腎透明細(xì)胞癌,、黑色素瘤,、非小細(xì)胞肺癌等實(shí)體腫瘤方面取得了臨床突破，然而在絕大多數(shù)CRC中,，ICB治療效果不佳,。目前廣泛使用的小鼠結(jié)直腸癌模型對(duì)免疫治療反應(yīng)較好，與人類結(jié)直腸癌的情況存在明顯不同,，既往文獻(xiàn)表明,，APC、KRAS和TP53基因突變?cè)贑RC中更為常見(jiàn),，因此研究團(tuán)隊(duì)在特異性靶向結(jié)腸上皮的他莫昔芬誘導(dǎo)CDX2-CreERT2小鼠中分別構(gòu)建了單基因（Apc,，SingleMut）、雙基因（Apc和Tp53,，DoubleMut）和三基因突變（Apc,、Tp53和Kras G12D，TripleMut）模型,。

隨著他莫昔芬劑量增加,，小鼠生存時(shí)間逐漸縮短。對(duì)于接受同等劑量他莫昔芬誘導(dǎo)的小鼠,，TripleMut小鼠的平均生存期大約比DoubleMut小鼠短50%,。此外，與SingleMut或DoubleMut小鼠相比,，TripleMut小鼠的腫瘤數(shù)量增加,，組織學(xué)分級(jí)更高，且發(fā)生了肺和肝轉(zhuǎn)移,。

TripleMut小鼠的平均生存期更短,，腫瘤數(shù)量增加，組織學(xué)分級(jí)更高,，且發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

研究團(tuán)隊(duì)接著評(píng)估了每個(gè)小鼠模型對(duì)PD-L1抑制劑的反應(yīng),。結(jié)果顯示，接受PD-L1抑制劑治療后,，SingleMut小鼠和DoubleMut小鼠生存率增加,，TripleMut小鼠生存率未見(jiàn)明顯提高，表明TripleMut小鼠模型對(duì)免疫治療具有耐藥性,。

結(jié)腸癌原位轉(zhuǎn)移小鼠模型對(duì)免疫治療具有耐藥性

基因集富集分析顯示,，與DoubleMut小鼠相比，TripleMut小鼠的適應(yīng)性免疫和T細(xì)胞功能相關(guān)通路顯著下調(diào),。質(zhì)譜流式分析顯示,，TripleMut小鼠中CD44⁺/CD45^-細(xì)胞增加,，即腫瘤干細(xì)胞的比例增加。同時(shí),，TripleMut小鼠CD45⁺細(xì)胞和CD3⁺細(xì)胞顯著減少,，CD4⁺細(xì)胞和CD8⁺T細(xì)胞數(shù)量有所減少但不明顯，表達(dá)抑制受體CTLA-4和PD-1的CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞顯著增加,。DoubleMut小鼠和TripleMut小鼠中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞無(wú)明顯差異,。總的來(lái)說(shuō),，這些發(fā)現(xiàn)表明TripleMut小鼠整體T細(xì)胞更少,，且存在更明顯的T細(xì)胞功能障礙。

在TripleMut小鼠中,，T細(xì)胞減少,，表達(dá)抑制受體的T細(xì)胞增加

為了確定DoubleMut和TripleMut小鼠之間差異表達(dá)基因所必需的上游調(diào)控因子，研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合CHIP-SEQ,、RNA-SEQ結(jié)果,，通過(guò)生物信息學(xué)分析將研究聚焦到與KRAS相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，最終確定了四個(gè)潛在的候選蛋白：GFI,、HNF4a,、RUNX1和IRF蛋白家族。

分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)數(shù)據(jù)集評(píng)估HNF4a及其直接靶點(diǎn)（癌性和正常結(jié)腸中的OTC）的RNA表達(dá)后發(fā)現(xiàn),，與正常結(jié)腸組織相比,，CRC中HNF4a和OTC表達(dá)明顯下調(diào)。SingleMut,、DoubleMut和TripleMut小鼠模型顯示腫瘤上皮中Otc和Hnf4a表達(dá)水平也顯著降低,，且TripleMut小鼠中這一改變最明顯。

由于發(fā)現(xiàn)了Hnf4a,、Otc和其他氨相關(guān)基因的下調(diào),，研究團(tuán)隊(duì)評(píng)估了CRC中氨的積聚情況，與DoubleMut相比,，TripleMut小鼠結(jié)腸上皮氨染色顯著增加，質(zhì)譜分析進(jìn)一步驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn),。

研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn),，在三種胃腸道癌癥（結(jié)腸癌、胃癌和肝細(xì)胞癌）中,，氨相關(guān)基因表達(dá)與生存率降低相關(guān),，且這一特征存在胃腸道特異性。

這些結(jié)果表明,，小鼠和人類結(jié)直腸癌中氨代謝失調(diào)導(dǎo)致瘤內(nèi)氨積聚,，可通過(guò)氨相關(guān)基因表達(dá)情況對(duì)結(jié)直腸癌患者進(jìn)行預(yù)后分層,。

晚期結(jié)直腸癌氨代謝異常

由于前期研究結(jié)果表明，TripleMut小鼠整體T細(xì)胞更少,，且存在更明顯的T細(xì)胞功能障礙,，研究團(tuán)隊(duì)接著探索了腫瘤微環(huán)境中氨的積聚對(duì)T細(xì)胞的影響。

研究團(tuán)隊(duì)分離了野生型小鼠T細(xì)胞,，在體外用氨處理后進(jìn)行靶向代謝組學(xué)檢測(cè),，結(jié)果顯示，氨處理后T細(xì)胞轉(zhuǎn)硫途徑失調(diào),。在體外和體內(nèi)氨處理CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞后,，觀察到活性氧（ROS）和脂質(zhì)過(guò)氧化顯著增加，但在CRC細(xì)胞系中沒(méi)有這一現(xiàn)象,。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，高氨水平通過(guò)轉(zhuǎn)硫途徑的失調(diào)誘導(dǎo)T細(xì)胞氧化應(yīng)激。

氨通過(guò)抑制轉(zhuǎn)硫途徑誘導(dǎo)T細(xì)胞氧化應(yīng)激

根據(jù)上述研究結(jié)果,，研究團(tuán)隊(duì)嘗試進(jìn)行氨清除,，降低氨水平。鳥(niǎo)氨酸可以通過(guò)刺激尿素循環(huán)和谷氨酰胺合成來(lái)清除氨,，在臨床上被應(yīng)用于高氨血癥患者,。飲食中添加氨的小鼠接受鳥(niǎo)氨酸治療后，血清氨顯著降低,，T細(xì)胞增殖增加,，T細(xì)胞功能恢復(fù)。

另外,，鳥(niǎo)氨酸治療顯著抑制CRC模型小鼠腫瘤生長(zhǎng),，腫瘤Ki67的表達(dá)和氨水平顯著降低，CD44⁺腫瘤干細(xì)胞減少,，CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞增加,。

中和氨可以減少結(jié)直腸癌腫瘤的生長(zhǎng)

確認(rèn)降低氨水平可以挽救CRC小鼠模型中氨驅(qū)動(dòng)的T細(xì)胞功能缺陷后，研究團(tuán)隊(duì)還評(píng)估了降低氨水平是否能提高PD-L1抑制劑治療CRC的療效,。結(jié)果表明,，單獨(dú)使用PD-L1抑制劑或鳥(niǎo)氨酸不能提高小鼠存活率，但鳥(niǎo)氨酸和PD-L1聯(lián)合治療可顯著提高生存率,。PD-L1抑制劑和鳥(niǎo)氨酸聯(lián)合治療可顯著抑制T細(xì)胞衰竭,，促進(jìn)T細(xì)胞浸潤(rùn)。

降低氨水平可以提高CRC對(duì)ICB敏感性

總的來(lái)說(shuō),，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)ICB治療無(wú)反應(yīng)和/或預(yù)后較差的CRC患者TME中氨水平升高,，氨是CRC中關(guān)鍵的免疫抑制廢物。在CRC晚期,，OTC和HNF4a表達(dá)下調(diào),，導(dǎo)致氨積聚,，T細(xì)胞轉(zhuǎn)硫調(diào)節(jié)異常，T細(xì)胞衰竭增加,，從而導(dǎo)致ICB耐藥,。清除氨能夠重新激活T細(xì)胞，可以作為提高ICB在CRC中的有效性的新方法,。

氨積累在結(jié)直腸癌進(jìn)展中的作用概要圖

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本文作者丨渠清源

責(zé)任編輯丨代絲雨