| 目的:采用網(wǎng)絡藥理學聯(lián)合人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)體外模型,探討鹿角霜能否通過干預TGF-β信號通路抑制腫瘤干細胞樣特性發(fā)揮抗腫瘤作用,為補腎類中藥鹿角霜在乳腺癌預防及治療的臨床應用提供理論依據(jù)。方法:1.采用中醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫BATMAN-TCM和中國知網(wǎng)收集鹿角霜的化學成分信息,利用BATMAN-TCM和TCMSP數(shù)據(jù)庫預測各化學成分的潛在靶點,用Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲取乳腺癌干細胞靶點,二者取交集獲得鹿角霜干預乳腺癌干細胞潛在靶點,用String數(shù)據(jù)庫對潛在靶點進行蛋白互作分析,獲得鹿角霜干預乳腺癌干細胞關鍵靶點和化合物,利用Metascape數(shù)據(jù)庫進行GO和KEGG通路注釋分析,利用Cytoscape3.8.0軟件對鹿角霜干預乳腺癌干細胞的藥物-成分-靶點-通路構建網(wǎng)絡圖,并進行分析,。2.將細胞分為四組,空白對照組,、0.2mg·m L~(-1)鹿角霜含藥血清處理組、0.4mg·m L~(-1)鹿角霜含藥血清處理組和0.6mg·m L~(-1)鹿角霜含藥血清處理組,。培養(yǎng)24h后顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并記錄;采用CCK-8細胞增殖實驗檢測鹿角霜含藥血清對乳腺癌細胞MDA-MB-231増殖程度的影響;采用軟瓊脂集落形成實驗檢測鹿角霜含藥血清對乳腺癌細胞MDA-MB-231集落形成能力的影響;采用實時熒光定量方法檢測鹿角霜含藥血清作用于乳腺癌細胞MDA-MB-231后TGF-β信號通路中TGFBR1和SMAD2的m RNA轉錄水平;采用Western Blot方法檢測鹿角霜含藥血清作用于乳腺癌細胞MDA-MB-231后TGF-β信號通路中TGFBR1和SMAD2的蛋白表達水平,。結果:1.從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫和知網(wǎng)獲得鹿角霜成分33個,從BATMAN-TCM和TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得鹿角霜潛在靶點16377個,從Gene Cards數(shù)據(jù)庫獲得乳腺癌干細胞靶點688個,將鹿角霜和乳腺癌靶點取交集后獲得共有靶點503個,用String數(shù)據(jù)庫對503個共有靶點進行蛋白互作分析,篩選得到20個核心靶點IL6、VEGFA,、GAPDH,、STAT3、INS,、TNF,、CXCL8、AKT1,、MAPK3,、MYC、MAPK1,、TP53,、FN1、CASP3,、MMP9,、JUN、CXCR4、EGF,、SRC,、NOTCH1及其相對應的6個關鍵化合物磷酸鈣、碳酸鈣,、丙氨酸,、天冬氨酸、絲氨酸,、蘇氨酸,利用Metascape數(shù)據(jù)庫對503個共有靶點進行基因功能分析,得到生物學過程3938條,主要參與了調(diào)節(jié)細胞粘附,、調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、淋巴細胞活化,、轉移酶活性的正調(diào)控,、血管發(fā)育,、細胞群增殖的負調(diào)控,、激酶活性的正調(diào)控,、血管發(fā)育、MAPK級聯(lián)的調(diào)節(jié),、白細胞分化等;細胞組分208條,主要參與了膜的側面,、受體復合物,、細胞質核周區(qū)、膜筏,、膜微區(qū),、質膜蛋白復合物,、質膜外側,、粘著,、細胞-基底連接,、轉移酶復合物等;分子功能326條,主要是激酶結合、轉錄因子結合,、激酶活性,、蛋白質結構域特異性結合、蛋白激酶結合,、磷酸轉移酶活性,醇基為受體,、蛋白激酶活性、受體調(diào)節(jié)活性,、受體配體活性,、信號受體激活劑活性等,。京都基因本體論分析170條,主要是癌癥的途徑,、PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路,、Rap1信號通路、乳腺癌、細胞因子-細胞因子受體相互作用、MAPK信號通路,、TGF-β信號通路,、Wnt信號通路、刺猬信號通路,、Notch信號通路等。通過鹿角霜干預乳腺癌干細胞的藥物-成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖說明鹿角霜可以通過“多成分-多靶點-多通路”來干預乳腺癌干細胞,。2.鹿角霜含藥血清對乳腺癌細胞MDA-MB-231形態(tài)的影響與空白對照組相比,鹿角霜含藥血清組的MDA-MB-231細胞數(shù)量明顯減少,存活能力下降,細胞稀落,形態(tài)不規(guī)則,體積明顯縮小,部分細胞脫落,懸于培養(yǎng)液之中,。3.鹿角霜含藥血清對乳腺癌細胞MDA-MB-231増殖的影響CCK-8細胞增殖實驗結果顯示,與空白對照組相比,0.2mg·m L~(-1)、0.4mg·m L~(-1),、0.6mg·m L~(-1)三種不同濃度鹿角霜含藥血清均可以抑制乳腺癌細胞增殖(P<0.05),而濃度為0.6mg·m L~(-1)的鹿角霜含藥血清對MDA-MB-231細胞增殖的抑制作用最顯著;軟瓊脂集落形成實驗結果顯示,三種不同濃度鹿角霜含藥血清均可以抑制乳腺癌細胞集落形成數(shù)(P<0.05),而0.6mg·m L~(-1)的鹿角霜含藥血清對細胞集落形成數(shù)的抑制作用最顯著,。4.鹿角霜含藥血清對TGF-β信號通路中TGFBR1、Smad2表達量的影響實時熒光定量實驗結果顯示,與空白對照組相比,0.2mg·m L~(-1)、0.4mg·m L~(-1),、0.6mg·m L~(-1)三種不同濃度鹿角霜含藥血清干預24h后的乳腺癌MDA-MB-231細胞中TGFBR1,、Smad2 m RNA轉錄水平顯著降低(P<0.01);Western Blot實驗結果顯示,與空白對照組相比,0.2mg·m L~(-1),、0.4mg·m L~(-1)、0.6mg·m L~(-1)三種不同濃度鹿角霜含藥血清干預24h后的乳腺癌MDA-MB-231細胞中TGFBR1,、Smad2蛋白表達水平顯著降低(P<0.01),。結論:本研究從網(wǎng)絡藥理學和體外細胞模型中發(fā)現(xiàn),鹿角霜不同濃度含藥血清中的多個組分,能夠協(xié)同作用于乳腺癌干細胞的目標差異表達基因,并通過下調(diào)TGF-β通路中關鍵分子TGFBR1及下游信號Smad2蛋白的表達水平,抑制乳腺癌細胞增殖,發(fā)揮抗乳腺癌作用。 |
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