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2022年12月02日，澳大利亞悉尼加爾文醫(yī)學(xué)研究所基因組學(xué)和表觀遺傳學(xué)系Ozren Bogdanovic研究團隊在《SCIENCE ADVANCES》雜志發(fā)表了題為“Active DNA demethylation of developmental cis-regulatory regions predates vertebrate origins”的研究論文,，該研究通過WGBS,、ACE-seq、hMeDIP-seq,、ATAC-seq等技術(shù)對海膽（sea urchin,，Strongylocentrotus purpuratus）、文昌魚（lancelet,，Branchiostoma lanceolatum）等動物胚胎和成體組織進(jìn)行測序分析,，揭示了動物發(fā)育過程中從調(diào)控區(qū)域主動去除5mC早于脊椎動物起源。

標(biāo)題：Active DNA demethylation of developmental cis-regulatory regions predates vertebrate origins

時間：2022.12.02

期刊：SCIENCE ADVANCES

影響因子：IF 14.957

技術(shù)平臺：WGBS,、ACE-seq,、hMeDIP-seq、ATAC-seq

樣本實驗：

海膽,、文昌魚胚胎和成體組織進(jìn)行WGBS,、ACE-seq、hMeDIP-seq,、ATAC-seq測序分析,，實驗各設(shè)置2個生物學(xué)重復(fù)

研究思路：

摘要：

DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶(5mC)）是脊椎動物胚胎發(fā)生所需的抑制基因調(diào)控標(biāo)記?；蚪M5mC通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（沉積5mC）和TET酶（通過形成5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）參與其活性去除）的作用而受到嚴(yán)格調(diào)控,。TET酶對哺乳動物原腸胚形成和脊椎動物發(fā)育增強子的激活至關(guān)重要，然而迄今為止仍對無脊椎動物譜系中的5hmC功能,、豐度和基因組分布缺乏清晰的了解,。本研究通過對海膽和文昌魚胚胎發(fā)生過程中的5mC和5hmC譜進(jìn)行單堿基定量分析，闡明了無脊椎動物5hmC和TET酶的作用,。研究發(fā)現(xiàn)無脊椎后口動物（invertebrate deuterostomes）通過TET酶靶向去甲基化與發(fā)育基因相關(guān)的調(diào)控區(qū)域,，并表明已鑒定的5hmC調(diào)控基因的補體在脊椎動物中保守。本研究表明，從調(diào)控區(qū)域主動去除5mC是后口動物胚胎發(fā)生的共同特征,，暗示了主要基因調(diào)控模塊的意外深度保守,。

結(jié)果圖形：

（1）TET酶的結(jié)構(gòu)和功能保守

圖1：TET蛋白序列、催化結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)和發(fā)育表達(dá)的進(jìn)化保守性

（A） 使用SWISS-MODEL和HMMER預(yù)測海膽,、文昌魚和斑馬魚TET蛋白結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu),。海膽sTet、佛羅里達(dá)文昌魚bTet和斑馬魚Tet3含有N-端DNA結(jié)合CxxC結(jié)構(gòu)域和包含大型低復(fù)雜性插入片段的C-端催化DSBH結(jié)構(gòu)域,。

（B） 人/小鼠/斑馬魚TET1/TET2/TET3以及海膽/文昌魚/果蠅TET催化核心結(jié)構(gòu)域的多序列比對,。顯示了DSBH的一部分。每種氨基酸的顏色表示百分比同一性（PID）,，深藍(lán)表示高PID,，淺藍(lán)表示低PID。（C） 使用SWISS-MODEL進(jìn)行海膽sTet,、文昌魚bTet和斑馬魚Tet3的甲基胞嘧啶雙加氧酶結(jié)構(gòu)域的三維模型。人TET2-5fC復(fù)合體（5d9y.1.A）晶體結(jié)構(gòu)用于模型構(gòu)建,。藍(lán)色表示ɑHelix,，綠色表示βsheet。

（D） TET基因在海膽,、文昌魚和斑馬魚發(fā)育過程中的表達(dá)變化,。a.a表示amino acids；2-OG表示2-oxoglutarate,；CPM表示百萬計數(shù)（counts per million）,；hpf表示受精后小時數(shù)（hours post fertilization）。

（2）WGBS揭示海膽和文昌魚基因組的DNA甲基化含量和變化

為量化可作為TET氧化和5hmC形成基底的基因組5mC數(shù)量,，作者利用WGBS繪制了海膽發(fā)育過程的4個時期相對應(yīng)的5mC譜,，分別為受精后24小時（24hpf，囊胚）,、受精后48小時（48 hpf,，原腸胚）、受精后72小時（72hpf,，pluteus）和成體時期（tube feet）,。此外還分析了8 hpf（囊胚，G3）,、15 hpf（原腸胚,，G6）、36 hpf（神經(jīng)胚,，T0）和成體（肝臟,，A）時期文昌魚胚胎發(fā)生的WGBS數(shù)據(jù)（圖2A）。結(jié)果與先前研究一致，平均甲基化水平（海膽23-28%,，文昌魚21-25%）與典型的無脊椎動物甲基體模式一致,，大多數(shù)基因組5mC位于表達(dá)基因的基因體內(nèi)。值得注意的是,，海膽和文昌魚的成體樣本顯示出非常低的5mC水平,。鑒于無脊椎動物中基因表達(dá)與基因體5mC之間的正相關(guān)關(guān)系，成體組織中的5mC水平較低可能由這些組織的表達(dá)基因數(shù)量少或總轉(zhuǎn)錄output低的特異性轉(zhuǎn)錄譜導(dǎo)致,。為此作者分析了多個發(fā)育時期和成體組織的轉(zhuǎn)錄組,，揭示了海膽和文昌魚兩種生物所有檢測樣本的平均表達(dá)譜（圖2B）。結(jié)果表明在成體組織中觀察到的5mC丟失可能并非由復(fù)雜轉(zhuǎn)錄的重大變化引起,，而是與更頻繁使用順式調(diào)控元件相關(guān)的染色質(zhì)可及性逐漸增加有關(guān),。根據(jù)這些結(jié)果，作者無法在成體組織中檢測到海膽和文昌魚DNMT轉(zhuǎn)錄本的任何主要發(fā)育下調(diào),。

由于海膽和文昌魚DNMT對脊椎動物的高度結(jié)構(gòu)保守,，為進(jìn)一步了解5mC的發(fā)育動態(tài)變化，作者鑒定出基因組區(qū)域在5mC水平上顯示出顯著的發(fā)育變化（錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05,，ΔmCG/CG≥ 0.2）（圖2C）,。研究分別在海膽和文昌魚基因組中鑒定20072和8136個差異甲基化區(qū)域（DMR），其中大多數(shù)對應(yīng)于幼體到成體（larva/pluteus-to-adult）的轉(zhuǎn)變（圖2D）,。大部分（86%的海膽和80%的文昌魚）已鑒定的DMR與發(fā)育性低甲基化相關(guān)（圖2C和D）,。結(jié)果與海膽和文昌魚兩種生物成體組織中5mC的整體較低水平一致（圖2A）?？傊?，研究發(fā)現(xiàn)采樣的無脊椎后口動物的胚胎發(fā)生存在顯著的5mC發(fā)育丟失，且不能通過轉(zhuǎn)錄活性或DNMT表達(dá)的發(fā)育變化來解釋,。

圖2：海膽和文昌魚發(fā)育過程中的DNA甲基化變化

（A） 海膽和文昌魚發(fā)育過程中的平均DNA甲基化（mCG/CG）水平,。

（B） 海膽和文昌魚發(fā)育過程中的平均基因表達(dá)（CPM+1）水平。

（C） 海膽和文昌魚基因組的胚胎和成體階段之間鑒定的低甲基化DMR（hypoDMR）數(shù)量,。

（D） 海膽和文昌魚基因組中成體hypoDMR的DNA甲基化（mCG/CG）熱圖,。

（3）ACE-seq和hMeDIP-seq揭示5hmC景觀的發(fā)展動態(tài)變化

圖3：海膽和文昌魚發(fā)育的DNA羥甲基化景觀

1. 海膽、文昌魚和斑馬魚的胚胎和成體組織中甲基化和羥甲基化CpG百分比,。分析包括甲基化至少80% CpG位點和羥甲基化至少10% CpG位點（P adj.<0.05）,。僅考慮覆蓋率＞10X的CpG位點。

2. 海膽48hpf和文昌魚60hpf樣品生物學(xué)重復(fù)之間羥甲基化水平的一致性,。

（C-D） 海膽（C）和文昌魚（D）胚胎和成體組織中甲基化（mC）,、羥甲基化（hmC）、未甲基化（C）CpG狀態(tài)之間關(guān)系的三元圖,。圖中顯示海膽48hpf（C）和文昌魚60hpf（D）羥甲基化的CpG位點（P<0.05）,。

（E-F） 海膽（E）和文昌魚（F）中開放染色質(zhì)區(qū)域（ATAC-seq）的DNA羥甲基化變化（ACE-seq）熱圖,。ACE-seq和ATAC-seq信號在ATAC-seq peaks上的K均值聚類（K=2）。海膽（E）和文昌魚（F）發(fā)育過程中DNA羥甲基化和DNA甲基化變化箱形圖,。

（G） IGV瀏覽器跟蹤描繪開放染色質(zhì)區(qū)域（ATAC-seq）的DNA羥甲基化（ACE-seq和hMeDIP-seq）富集與海膽和文昌魚基因組中的DNA去甲基化（WGBS）一致,。

（4）ATAC-seq揭示5hmC與發(fā)育基因激活

圖4：5hmC標(biāo)記基因的發(fā)育表達(dá)

（A） 海膽和文昌魚在啟動子和基因體區(qū)域5hmC標(biāo)記的ATAC-seq peaks基因的GO分析。

（B） 不同基因組區(qū)域5hmC標(biāo)記的ATAC-seq peaks百分比,。

（C） 啟動子相關(guān)5hmC標(biāo)記的ATAC-seq peaks（啟動子ATAC-hmC+）和非5hmC ATAC-seq peaks（啟動子ATAC-hmC?)的基因長度,。

（D） 與基因啟動子或基因體相關(guān)的ATAC-hmC+區(qū)域的HOMER motif富集分析。

（E） 啟動子ATAC-hmC+基因與啟動子ATAC-hmC-基因在海膽和文昌魚胚胎和成體組織中的表達(dá)變化,。

（5）5hmC標(biāo)記基因的保守調(diào)控機制

圖5：斑馬魚5hmC標(biāo)記基因的保守發(fā)育調(diào)控方式

（A） 2R/3R ohnolog斑馬魚在胚胎和成體組織中5hmC標(biāo)記的ATAC-seq peaks與phylo DMR重疊區(qū)域（5hmC/phylo DMR）,、5hmC標(biāo)記的ATAC-seq peaks與非phylo DMR重疊區(qū)域（5hmC/No phylo DMR）、非5hmC標(biāo)記的ATAC-seq peaks與非phylo DMR重疊區(qū)域（No 5hmC/ No phylo DMR）的基因表達(dá),。

（B） 24 hpf斑馬魚胚胎的7738個單細(xì)胞的UMAP投影,。細(xì)胞按組織類型進(jìn)行顏色編碼。

（C） 24hpf斑馬魚胚胎的5hmC/phylo DMR,、5hmC/No phylo DMR和No 5hmC/No phylo DMR三個基因組的z-scores得分,。模塊評分描述了每個基因組的平均基因表達(dá)與隨機對照基因之間的差異。

（D） 1k細(xì)胞和24hpf斑馬魚胚胎以及多個成體組織中5hmC/phylo DMR,、5hmC/No phylo DMR和No 5hmC/No phylo DMR ATAC-seq peaks的DNA甲基化譜熱圖,。

結(jié)論：

本研究使用全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）和ACE-seq在海膽和文昌魚四個發(fā)育時期分別生成5mC和5hmC的單堿基分辨率圖譜。將這些數(shù)據(jù)集與開放染色質(zhì)圖譜（ATAC-seq）數(shù)據(jù)進(jìn)行整合分析,，表明在兩種海膽和文昌魚兩種生物的調(diào)控區(qū)域DNA去甲基化顯著，有力地支持了無脊椎動物后口動物使用TET蛋白和5hmC進(jìn)行發(fā)育基因調(diào)控的觀點,。另外研究發(fā)現(xiàn)5hmC標(biāo)記基因的脊椎動物同源性與5hmC富集有關(guān),，并定義了斑馬魚的時空調(diào)控方式。研究表明至少在一些無脊椎動物譜系中,，5mC不僅可以預(yù)防假轉(zhuǎn)錄起始所需的基因活性,，還可以作為調(diào)控標(biāo)記在與關(guān)鍵發(fā)育過程相關(guān)的調(diào)控區(qū)域被積極重塑?？偟膩碚f,，本研究為無脊椎動物-脊椎動物的5mC/5hmC調(diào)控邏輯提供了新見解，并證明在動物發(fā)育過程中從調(diào)控區(qū)域主動去除5mC早于脊椎動物起源,。

關(guān)于易基因全基因組重亞硫酸鹽測序（WGBS）技術(shù)

全基因組重亞硫酸鹽甲基化測序（WGBS）可以在全基因組范圍內(nèi)精確的檢測所有單個胞嘧啶堿基（C堿基）的甲基化水平,，是DNA甲基化研究的金標(biāo)準(zhǔn)。WGBS能為基因組DNA甲基化時空特異性修飾的研究提供重要技術(shù)支持,，能廣泛應(yīng)用在個體發(fā)育,、衰老和疾病等生命過程的機制研究中，也是各物種甲基化圖譜研究的首選方法,。

易基因提供的全基因組甲基化測序技術(shù)通過T4-DNA連接酶,，在超聲波打斷基因組DNA片段的兩端連接接頭序列，連接產(chǎn)物通過重亞硫酸鹽處理將未甲基化修飾的胞嘧啶C轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏，進(jìn)而通過接頭序列介導(dǎo)的 PCR 技術(shù)將尿嘧啶U轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏,。

應(yīng)用方向：

WGBS廣泛用于各種物種,，要求全基因組掃描（不錯過關(guān)鍵位點）

• 全基因組甲基化圖譜課題

• 標(biāo)志物篩選課題

• 小規(guī)模研究課題

技術(shù)優(yōu)勢：

• 應(yīng)用范圍廣：適用于所有參考基因組已知物種的甲基化研究；

• 全基因組覆蓋：最大限度地獲取完整的全基因組甲基化信息,，精確繪制甲基化圖譜,；

• 單堿基分辨率：可精確分析每一個C堿基的甲基化狀態(tài)。

易基因科技提供全面的DNA甲基化研究整體解決方案,，技術(shù)詳情了解請致電易基因0755-28317900,。

參考文獻(xiàn)：

Skvortsova K, Bertrand S, Voronov D, Duckett PE, Ross SE, Magri MS, Maeso I, Weatheritt RJ, Gómez Skarmeta JL, Arnone MI, Escriva H, Bogdanovic O. Active DNA demethylation of developmental cis-regulatory regions predates vertebrate origins. Sci Adv. 2022 Dec 2;8(48):eabn2258.

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