*僅供醫(yī)學(xué)專業(yè)人士閱讀參考

新冠疫情爆發(fā)至今已經(jīng)三年,，雖然奧密克戎致病性有所減弱,，但新冠病毒仍在快速變異，而變異主要集中在S蛋白,。因此,，破解S蛋白核心變異對(duì)新冠病毒進(jìn)出細(xì)胞的影響，對(duì)新冠病毒溯源、抗體療法,、疫苗設(shè)計(jì)尤其重要,。

近日，由約翰·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院Stephen Gould教授領(lǐng)銜的研究團(tuán)隊(duì),，在著名期刊Science Advances發(fā)表重要研究成果【1】,。該論文的第一作者是郭晨栩，通訊作者是Stephen Gould,，其他研究人員包括蔡尚睿,、Yiwei Ai、Maggie Li,、Eduardo Anaya,、Andrew Pekosz和Andrea Cox。

論文首頁(yè)截圖

通過(guò)研究新冠病毒S蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn),，Gould團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)S蛋白是一種溶酶體蛋白，2020年初出現(xiàn)并迅速占據(jù)主導(dǎo)地位,、成為所有毒株共有的D614G突變并不是對(duì)人類宿主的適應(yīng),。相反，D614G的出現(xiàn)糾正了由早期弗林蛋白酶切割位點(diǎn)插入（FCSI）突變所引起的一系列S蛋白功能缺陷,，包括S蛋白向溶酶體的運(yùn)輸,。

Gould團(tuán)隊(duì)2020年底曾在預(yù)印平臺(tái)biorxiv上刊登過(guò)相關(guān)研究結(jié)果【2】，是世界首篇提供明確證據(jù)表明S蛋白能夠重塑溶酶體結(jié)構(gòu)和功能的論文,，進(jìn)一步支持以溶酶體為核心的β冠狀病毒進(jìn)出細(xì)胞的機(jī)理模型,，并揭示了D614G突變作為基因內(nèi)抑制因子，在新冠病毒進(jìn)化,、免疫,、預(yù)防、治療等方面的重要意義,。

論文第一作者郭晨栩（左一）,、通訊作者Stephen Gould（右一）和團(tuán)隊(duì)成員蔡尚睿（右三）、Yiwei Ai（左二）等

S蛋白是抗擊新冠病毒最關(guān)鍵的蛋白質(zhì),，因?yàn)樗R(shí)別并介導(dǎo)受體結(jié)合,，促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞，依然是絕大多數(shù)疫苗的唯一抗原和抗體療法的首要目標(biāo),，而且它還一直在快速變異,。

不同于其他SARS相關(guān)冠狀病毒，新冠病毒在其起源之時(shí)或之前獲得了FCSI突變,，使S蛋白能被弗林蛋白酶介導(dǎo)的加工預(yù)先激活,，以便其他絲氨酸蛋白酶如TMPRSS2進(jìn)行切割,，為新冠病毒提供了一種新的、不依賴于胞內(nèi)體/溶酶體的入侵機(jī)制去感染細(xì)胞,，從而使新冠病毒能夠通過(guò)呼吸系統(tǒng)快速,、有效地傳播。

盡管FCSI增加了新冠病毒可以采用的感染機(jī)制,、可以識(shí)別的受體范圍、可以感染的細(xì)胞類型以及可以傳播的途徑和效率,，但也引起了S蛋白結(jié)構(gòu)的顯著變化,。由于改變結(jié)構(gòu)的變異幾乎總會(huì)伴隨一些不利的副作用，F(xiàn)CSI會(huì)帶來(lái)有害的特性也就不足為奇了,。具體而言，FCSI導(dǎo)致內(nèi)體/溶酶體感染途徑出現(xiàn)重大缺陷,，新冠病毒在缺乏TMPRSS2表達(dá)的VeroE6等細(xì)胞系中復(fù)制不良，在連續(xù)傳代后,，迅速出現(xiàn)FCSI逆轉(zhuǎn)突變體【3-7】,。

新冠病毒感染宿主細(xì)胞的兩個(gè)途徑【7】

疫情開(kāi)始不久,，新冠病毒便獲得了另一個(gè)有利的變異（D614G突變）,。這是新冠病毒在人群中傳播后出現(xiàn)的第一個(gè)變異,，也是后來(lái)所有毒株共同擁有的變異,。它顯著增強(qiáng)了新冠病毒的感染力、傳播性和病毒載量,，奇點(diǎn)網(wǎng)此前也曾多次報(bào)道,。

一般來(lái)說(shuō)，病毒會(huì)朝著減少其細(xì)胞表面表達(dá)的方向進(jìn)化,，這可能是因?yàn)檫m應(yīng)性免疫反應(yīng)定向選擇了能夠更好地逃避免疫監(jiān)視的突變病毒,。為了檢測(cè)D614G是否能夠減少S蛋白在細(xì)胞膜上的表達(dá),，研究人員把新冠病毒原始毒株（WT）和D614G突變株的S蛋白克隆出來(lái),，分別整合到一個(gè)由四環(huán)素操縱子調(diào)控的基因表達(dá)體系中，并通過(guò)兩個(gè)不同的對(duì)照實(shí)驗(yàn)（生物素細(xì)胞表面標(biāo)記結(jié)合親和素親和層析分離,，以及細(xì)胞表面熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)）發(fā)現(xiàn),，D614G使細(xì)胞膜S蛋白的表達(dá)量降低至原來(lái)的三成水平，而這兩種S蛋白的總表達(dá)量相似,。

D614G導(dǎo)致細(xì)胞表面S蛋白表達(dá)量顯著下降

眾所周知,，蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)是一場(chǎng)零和博弈。鑒于S/WT和S/D614G的總表達(dá)水平相似,，既然D614G使其在細(xì)胞膜的表達(dá)量減少了70%,，那么它一定是被運(yùn)輸?shù)搅思?xì)胞內(nèi)部。

研究人員通過(guò)分析早期新冠患者的血漿,，利用不同患者產(chǎn)生的抗體,，追蹤S蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。果然,，他們?cè)诒磉_(dá)S/WT的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)烈的細(xì)胞表面信號(hào),，而在表達(dá)S/D614G的細(xì)胞中找到了更多的細(xì)胞內(nèi)部定位。有趣的是,，S/WT顯示出大量與高爾基體標(biāo)記物GM130熒光共定位,，而S/D614G則高度集中在多個(gè)大型非高爾基體細(xì)胞器中。

D614G導(dǎo)致大量S蛋白被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)部的非高爾基體細(xì)胞器中

此前曾有多則報(bào)道,，β冠狀病毒能將宿主細(xì)胞的溶酶體轉(zhuǎn)化為病毒儲(chǔ)存和釋放的容器,，所以新合成的β冠狀病毒顆粒不是通過(guò)經(jīng)典分泌途徑釋放的，而是被運(yùn)輸?shù)饺苊阁w并在那里不斷積累,，直到被溶酶體胞吐作用大量釋放,。

為了確定S/D614G高度集中的細(xì)胞器是否就是溶酶體，研究人員做了一系列實(shí)驗(yàn),，包括免疫熒光顯微,、免疫金電子顯微技術(shù)等，證實(shí)了（1）S蛋白是一種溶酶體蛋白并能引起溶酶體聚集,，（2）D614G將S蛋白從細(xì)胞膜重定向到溶酶體限制膜上,，（3）與S/WT相比，D614G導(dǎo)致更多的S蛋白（約1.5倍）轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體上,。

研究人員接下來(lái)測(cè)試了D614G在新冠病毒感染的情況下,，是否也會(huì)影響S蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。他們分別用原始毒株和D614G突變株感染Vero E6/TMPRSS2細(xì)胞,，用免疫熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)等方法分析,，得到了相似的結(jié)果。

在新冠病毒感染的細(xì)胞中,，D614G改變S蛋白的運(yùn)輸

至于新冠病毒為什么會(huì)發(fā)生D614G突變,，研究人員認(rèn)為，該突變出現(xiàn)的時(shí)間和重復(fù),、獨(dú)立的起源表明,，它的產(chǎn)生正是為了適應(yīng)新冠病毒進(jìn)化歷程中相對(duì)較新的事件，而在新冠病毒的近期歷史/史前歷史中只發(fā)生了兩起重大事件：由動(dòng)物傳染到人類,，以及新冠病毒特有的FCSI變異,。由此推理,，D614G出現(xiàn)的原因有兩種可能，一種是對(duì)其新宿主人類的進(jìn)化適應(yīng),，另一種是為了修正先前FCSI所帶來(lái)的不利影響而產(chǎn)生的進(jìn)化適應(yīng),。

研究人員首先在進(jìn)化史上距離人類較遠(yuǎn)的哺乳動(dòng)物負(fù)鼠的細(xì)胞中表達(dá)了S/WT和S/D614G兩種蛋白，并測(cè)量了S蛋白的總表達(dá)量和在細(xì)胞表面的表達(dá)水平,，得出了與之前一致的結(jié)論,，從而排除了“D614G是人類特有的進(jìn)化適應(yīng)”這一可能性。

接下來(lái),，Gould團(tuán)隊(duì)根據(jù)幾組不同的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),，抑制弗林蛋白酶或破壞FCSI，確實(shí)恢復(fù)了S蛋白向溶酶體運(yùn)輸?shù)哪芰?，而弗林蛋白酶介?dǎo)的S蛋白切割,，導(dǎo)致S蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體的功能出現(xiàn)明顯缺陷，并使細(xì)胞表面S蛋白的表達(dá)量增加約3倍,。研究人員認(rèn)為,，D614G通過(guò)還原S蛋白向溶酶體運(yùn)輸?shù)哪芰Γ种屏薙蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中與FCSI相關(guān)的有害特性,。

弗林蛋白酶和FCSI破壞了S蛋白向溶酶體的運(yùn)輸

在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)里,，研究人員利用遺傳學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，S蛋白向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)是由其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域調(diào)節(jié)的,。此外,，Gould團(tuán)隊(duì)基于多個(gè)對(duì)照試驗(yàn)，提供了首個(gè)明確證據(jù)表明,，僅僅依靠S蛋白的表達(dá)就足以驅(qū)動(dòng)溶酶體聚集,、KDEL受體在溶酶體積累、ER駐留蛋白的異常分泌,，甚至可能阻斷內(nèi)吞物質(zhì)的溶酶體攝取,。

新冠病毒通過(guò)胞內(nèi)體/溶酶體進(jìn)出細(xì)胞的模型

總的來(lái)說(shuō)，從細(xì)胞生物學(xué)的角度,，Gould團(tuán)隊(duì)首次證實(shí)新冠病毒S蛋白是一種溶酶體蛋白,，在β冠狀病毒感染的細(xì)胞中，除了受體結(jié)合,、膜融合以外,，還能改變?nèi)苊阁w的結(jié)構(gòu)并重塑溶酶體的功能。

從新冠病毒進(jìn)化的角度,，Gould團(tuán)隊(duì)的研究成果表明,，最早出現(xiàn)的兩個(gè)突變,，F(xiàn)CSI和D614G,，在功能上是密切相關(guān)的,。D614G突變的出現(xiàn)是為了修復(fù)FCSI引起的不良副作用而發(fā)生的進(jìn)化適應(yīng)，同時(shí)依然允許弗林蛋白酶切割S蛋白并支持新冠病毒在呼吸系統(tǒng)傳播,。

新冠病毒早期進(jìn)化的遺傳模型

Gould團(tuán)隊(duì)強(qiáng)調(diào),，新冠研究應(yīng)該拓寬考慮S蛋白突變的遺傳和功能背景，雖然所有S蛋白突變都可能代表對(duì)其環(huán)境的適應(yīng),，但也有可能是對(duì)先前突變的適應(yīng),。除了研究S蛋白突變對(duì)其受體結(jié)合、膜融合催化能力的作用,，還應(yīng)該關(guān)注這些突變對(duì)S蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)及其對(duì)S蛋白介導(dǎo)的溶酶體重編程的影響,。

參考文獻(xiàn)

1.https://www./doi/10.1126/sciadv.ade5085

2.https://www./content/10.1101/2020.12.08.417022v1

3.https://pubmed.ncbi.nlm./32571797/

4.https://pubmed.ncbi.nlm./32568027/

5.https://pubmed.ncbi.nlm./33476327/

6.https://pubmed.ncbi.nlm./33835028/

7.https://pubmed.ncbi.nlm./34159616/

責(zé)任編輯丨BioTalker