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黑色素是由黑色素細胞合成并分布于動物皮膚或者毛發(fā)的一種呈現(xiàn)黑褐色的物質(zhì),。正常的黑色素調(diào)控有利于抵御外界因素對皮膚的刺激傷害,，然而，異常的黑色素調(diào)控與積累會使皮膚出現(xiàn)各種斑點問題,，嚴重的可能會導(dǎo)致黑色素瘤,。因此，針對皮膚黑色素調(diào)控機理尋找治療皮膚黑色素異常相關(guān)疾病的藥物具有重要的意義,。光甘草定是一種提取自光果甘草的多酚黃酮類化合物,，除了顯著的美白活性，光甘草定還具有抗炎,、抗氧化,、神經(jīng)保護等多種生物活性，在心腦血管及化妝品領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用,。目前,，在皮膚黑色素方面，相關(guān)研究表明光甘草定有顯著的抑制黑色素生成及抗氧化作用,，這一作用可通過抑制酪氨酸酶的活性并下調(diào)黑色素生成相關(guān)因子的表達來實現(xiàn),，但潛在的機制仍未完全了解。廣東工業(yè)大學Chunxing Pan,、Zhiyun Du*,、Zhengqiang Yuan*等通過分子對接模擬、酪氨酸酶活性測定實驗,、建立α-黑色素細胞激素（α-Melanocyte-stimulatinghormone,，α-MSH）誘導(dǎo)B16黑色素瘤細胞的體外細胞模型及UVA輻射誘導(dǎo)小鼠色素沉著模型，系統(tǒng)性研究了光甘草定對黑色素調(diào)控作用及相關(guān)機制,，為光甘草定在皮膚黑色素調(diào)控方面的廣泛應(yīng)用提供了理論與實驗依據(jù),。
光甘草定對B16黑色素瘤細胞的細胞毒性如圖1所示，光甘草定在濃度不高于30 μmol/L時對B16細胞沒有細胞毒性,。因此,，選擇了5 μmol/L和30 μmol/L的光甘草定濃度用于開展后續(xù)的B16細胞實驗。
使用分子對接程序AutoDock（4.2.6）來模擬呈現(xiàn)光甘草定與酪氨酸酶,、小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（microphthalmia-associated transcription factor，MITF）之間的相互作用,。本環(huán)節(jié)選用了已知的酪氨酸酶活性抑制劑α-熊果苷和托酚酮作為參照對象,，結(jié)果如圖2所示，托酚酮方式通過與Asn260殘基形成氫鍵以及與活性位點中的2個銅離子形成兩個非氫鍵來與酪氨酸酶結(jié)合（圖2a）,。α-熊果苷通過與Asn260和Met280殘基形成氫鍵并與活性位點中的一個銅離子形成非氫鍵來與酪氨酸酶結(jié)合（圖2b）,。光甘草定通過與Met319和Glu322殘基形成氫鍵結(jié)合到酪氨酸酶的活性位點（圖2c）。光甘草定也可以通過與MITF的DNA結(jié)合位點中的Arg216和Asn219殘基形成氫鍵與MITF結(jié)合,，表明其可能直接抑制MITF轉(zhuǎn)錄活性（圖2d）,。分子對接模擬實驗中,，對接能量是估計配體與其受體之間相互作用的參數(shù)。光甘草定與酪氨酸酶和MITF的對接能分別為-7.16和-6.67 kcal/mol,。相比之下,，α-熊果苷和托酚酮與酪氨酸酶對接能量分別為-4.37和-4.89 kcal/mol。這表明光甘草定可以與酪氨酸酶和MITF結(jié)合并形成穩(wěn)定的復(fù)合物,。光甘草定可能比α-熊果苷和托酚酮具有更高的酪氨酸酶結(jié)合親和力,。
圖2 不同化合物與酪氨酸酶、MITF和化合物之間分子對接模擬結(jié)果體外酪氨酸酶單酚酶活性測定實驗,、體外的酪氨酸酶二酚酶活性測定實驗以及B16細胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定實驗結(jié)果表明,，光甘草定比α-熊果苷表現(xiàn)出更優(yōu)越的酪氨酸酶活性抑制效果（圖3a，b）,。已知酪氨酸酶是黑色素生成過程中的重要參與角色之一,，通過構(gòu)建α-MSH誘導(dǎo)B16黑色素瘤細胞產(chǎn)生黑色素的體外細胞模型，可以進一步測定光甘草定對B16細胞中黑色素生物合成的影響,。結(jié)果如圖3c,，d所示，光甘草定比α-熊果苷更顯著地抑制了B16細胞中的黑色素生成,。
圖3 光甘草定對蘑菇酪氨酸酶活性,、細胞內(nèi)酪氨酸酶活性和黑色素生成的抑制作用光甘草定通過調(diào)控黑色素生成相關(guān)因子來抑制B16細胞中的黑色素生成黑色素生成相關(guān)因子包括促黑素細胞激素受體（MC1R）、小眼相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（MITF）,、酪氨酸酶（TYR）,、TYR相關(guān)蛋白-1（TRP-1）和TYR相關(guān)蛋白-2（TRP-2）。光甘草定干預(yù)α-MSH誘導(dǎo)B16黑色素瘤細胞產(chǎn)生黑色素的體外細胞模型后,，通過Q-PCR和Western-blot檢測α-MSH誘導(dǎo)后的B16細胞中黑色素生成相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄與表達,，結(jié)果如圖4所示，光甘草定可通過下調(diào)黑色素生成相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和表達來抑制黑色素生成,。
圖4 光甘草定對B16細胞中黑色素生成相關(guān)因子表達的影響光甘草定通過調(diào)控PKA,、MAPK信號通路來抑制B16細胞中的黑色素生成α-MSH可以通過α-MSH/cAMP信號通路顯著增加黑色素細胞的酪氨酸酶活性，而PKA被cAMP激活,，磷酸化的PKA（p-pPKA）緊接著對CREB進行磷酸化修飾（p-CREB）,，激活MITF后促進黑色素的生成。而在MAPK通路中,，磷酸化的ERK（p-ERK）會觸發(fā)MITF的泛素化和降解,，從而使黑色素生成量下降。磷酸化的p38（p-p38）或磷酸化的JNK（p-JNK）激活MITF,，上調(diào)酪氨酸酶,、TRP-1和TRP-2等黑色素生成相關(guān)因子的蛋白合成，最終刺激黑色素細胞生成黑色素,。使用光甘草定對α-MSH誘導(dǎo)B16黑色素瘤細胞產(chǎn)生黑色素的體外細胞模型進行干預(yù),，結(jié)果如圖5所示,，光甘草定可顯著下調(diào)α-MSH誘導(dǎo)后的B16細胞中cAMP的表達（圖5a）,，抑制下游的PKA/CREB,、P38、JNK信號通路的磷酸化進程,，同時促進ERK信號通路的磷酸化進程（圖5b,，c），從而在一定程度上抑制刺激黑色素生成的信號傳遞,，最終減少黑色素的生成,。
圖5 光甘草定對PKA和MAPK途徑中黑色素生成相關(guān)因素表達的影響光甘草定可改善UVA輻射誘導(dǎo)的小鼠皮膚色素沉著UVA輻射會導(dǎo)致皮膚黑色素過度合成、沉淀,，因此本環(huán)節(jié)構(gòu)建了UVA輻射誘導(dǎo)小鼠色素沉著模型（圖6a）來評估光甘草定的體內(nèi)抗黑色素生成活性,，結(jié)果表明，光甘草定可顯著改善UVA小鼠背部皮膚黑色素沉淀,、紅腫,、干燥脫屑現(xiàn)象（圖6b，c）,。收集小鼠背部的皮膚,，通過Elisa、HE染色檢測發(fā)現(xiàn),，光甘草定顯著降低了UVA輻射后皮膚中cAMP的表達,，并有效緩解了因UVA輻射導(dǎo)致的皮膚受損、表皮增厚（圖6d,，e）,。通過Fontana-Masson染色實驗可觀察到，UVA輻射后皮膚中黑色素顯著增加,，而光甘草定干預(yù)后可有效地減少了表皮中黑色素的沉積（圖6f）,。以上實驗數(shù)據(jù)表明，光甘草定的給藥干預(yù)可以減輕UVA引起的皮膚炎癥,、黑色素的生成和在表皮中的積累,。
圖6 光甘草定對UVA輻射小鼠的皮膚色素合成和cAMP表達的影響綜上所述，本研究從分子對接模擬,、酪氨酸酶活性測定實驗,、α-MSH誘導(dǎo)B16黑色素瘤細胞的體外細胞模型及UVA輻射誘導(dǎo)小鼠色素沉著模型的角度，證實了光甘草定具有優(yōu)越的抑制黑色素合成的作用,，并揭示了背后的可能機制,，為光甘草定在皮膚黑色素調(diào)控方面的更廣泛應(yīng)用提供了理論和實驗依據(jù)。
The mechanisms of melanogenesis inhibition by glabridin: molecular docking, PKA/MITF and MAPK/MITF pathwaysChunxing Pana,1, Xiaoying Liub, Yating Zhenga, Zejun Zhanga, Yongliang Lic, Biao Cheb, Guangrong Liub, Lanyue Zhanga, Changzhi Dongd, Haji Akber Aisae, Zhiyun Dua,*, Zhengqiang Yuana,* a School of Biomedical and Pharmaceutical Sciences, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China b Infinitus(China) Company Ltd., Guangzhou 510663, China c Foshan Allen Conney Biological Technology Co., Ltd., Foshan 528225, China d Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité, ITODYS, UMR 7086 CNRS, France e The Key Laboratory of Plant Resources and Chemistry of Arid Zone, Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry, Chi nese Academy of Sciences, ürümqi 830011, China 1 These authors contributed equally to this work. *Corresponding authors. AbstractGlabridin is the main ingredient of hydrophobic fraction in licorice extract and has been shown to have anti-melanogenesis activity in skins. However, the underlying mechanism(s) remain not completely understood. The aim of this study is thus to elucidate the possible mechanisms related to the melanogenesis suppression by glabridin in cultured B16 murine melanoma cells and in UVA radiation induced hyperpigmentation model of BALB/c mice as well. Molecular docking simulations revealed that between catalytic core residues and the compound. The treatment by glabridin significantly downregulated both transcriptional and/or protein expression of melanogenesis-related factors including melanocyte stimulating hormone receptor (MC1R), microphthalmia-associated transcription factor (MITF), tyrosinase (TYR), TYR-related protein-1 (TRP-1) and TRP-2 in B16 cells. Both PKA/MITF and MAPK/MITF signaling pathways were found to be involved in the suppression of melanogenesis by glabridin in B16 cells. Also in vivo glabridin therapy significantly reduced hyperpigmentation, epidermal thickening, roughness and inflammation induced by frequent UVA exposure in mice skins, thus beneficial for skin healthcare. These data further look insights into the molecular mechanisms of melanogenesis suppression by glabridin, rationalizing the application of the natural compound for skin healthcare. PAN C X, LIU X Y, ZHENG Y T, et al. The mechanisms of melanogenesis inhibition by glabridin: molecular docking, PKA/MITF and MAPK/MITF pathways[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(1): 212-222. DOI:10.1016/j.fshw.2022.07.011.
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