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自2001年起,，已經(jīng)有76種小分子激酶抑制劑（SMKI）被FDA批準(zhǔn)用于癌癥和其他疾病的治療。但SMKI研發(fā)仍然面臨兩個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)：首先,，大多數(shù)SMKI結(jié)合在激酶的保守ATP口袋,，因此在人類激酶組中缺乏選擇性；其次,，使用SMKI一段時(shí)間后通常會(huì)發(fā)生獲得性耐藥,，主要由激酶自身的二級(jí)或三級(jí)突變（on-target resistance）或下游和旁路激活（off-target resistance）驅(qū)動(dòng)，這也成為靶向抗腫瘤藥物臨床耐藥的主要原因,。
2020年,，暨南大學(xué)藥學(xué)院陸小云研究團(tuán)隊(duì)在藥物化學(xué)頂級(jí)期刊（J. Med. Chem. 2020, 63, 10726?10741）綜述了已經(jīng)上市的激酶藥物中克服點(diǎn)突變的藥物研發(fā)實(shí)例,，詳細(xì)總結(jié)了藥物發(fā)生點(diǎn)突變而引起耐藥的原因及目前可以克服點(diǎn)突變的藥物化學(xué)策略（圖1）。靶點(diǎn)點(diǎn)突變導(dǎo)致耐藥的主要機(jī)制包括：（i）引起空間位阻或電性相斥以降低藥物結(jié)合能力,；（ii）增加ATP對(duì)ATP結(jié)合域的親和力,，使藥物更難競(jìng)爭(zhēng)占據(jù)活性位點(diǎn)；（iii）干擾抑制劑和蛋白活性位點(diǎn)之間形成共價(jià)鍵,。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研,，克服點(diǎn)突變的藥物化學(xué)策略主要包括：（i）避免與突變殘基的空間位阻，減少突變?cè)斐傻幕钚該p失,；（ii）與突變殘基相互作用或與活性位點(diǎn)半胱氨酸形成共價(jià)鍵等方式增加抑制劑結(jié)合活性,。但仍缺乏一種較為通用的藥物化學(xué)改造策略針對(duì)不同激酶的耐藥突變情況。
研究團(tuán)隊(duì)認(rèn)為：構(gòu)象限制的大環(huán)策略一方面能通過(guò)構(gòu)象的改變,，減少分子與激酶口袋特定耐藥突變氨基酸殘基產(chǎn)生的空間位阻（如：溶劑前沿殘基和守門殘基的點(diǎn)突變）,。另一方面，由于大部分激酶抑制劑采用“U”型構(gòu)象結(jié)合,，通過(guò)構(gòu)象的限制,，可以固定其最低能量構(gòu)象以降低結(jié)合時(shí)能量的損失。因此,，有潛力作為解決激酶抑制劑點(diǎn)突變耐藥的常用策略,。
 圖1. 常見(jiàn)克服激酶突變的藥物化學(xué)策略（來(lái)源：J. Med. Chem.）
構(gòu)象限制的大環(huán)策略用于新一代激酶抑制劑的研究
近期，該團(tuán)隊(duì)針對(duì)臨床已出現(xiàn)耐藥的治療肺癌的主要靶點(diǎn),，如EGFR,、c-Met和TRK等，采用構(gòu)象限制大環(huán)化策略獲得克服不同點(diǎn)突變耐藥的新一代的激酶小分子抑制劑,。主要簡(jiǎn)述如下,。
1. c-Met大環(huán)抑制劑（Journal of Medicinal Chemistry, 2022, DOI: 10.1021/acs.jmedchem.2c00981）自2020年起，高選擇性的I型c-Met抑制劑capmatinib,、tepotinib,、savolitinib相繼被獲批用于攜帶MET14外顯子跳躍突變的非小細(xì)胞肺癌患者。然而,，在使用c-Met抑制劑后會(huì)出現(xiàn)獲得性耐藥,，主要為I型的Y1230C和D1228V/N/H突變、II型的F1200L和L1195V突變,。另一方面,，有研究表明：HGF/c-Met信號(hào)通路與胃癌的形成發(fā)展也密切相關(guān)，部分c-Met抑制劑在臨床實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)被證實(shí)對(duì)胃癌有一定的治療效果,，但是目前尚無(wú)c-Met抑制劑藥物獲批用于胃癌的治療,。因此，開(kāi)發(fā)新型的c-Met抑制劑是十分有必要的,。首先,，基于tepotinib和NVP-BVU972與c-Met的晶體結(jié)構(gòu)分析,，研究人員首先使用雜化策略，得到先導(dǎo)化合物9b（圖2）,，進(jìn)一步對(duì)噠嗪酮上的苯基（藍(lán)色）進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系探討,，得到具有較強(qiáng)激酶活性與細(xì)胞活性的化合物9y (c-Met IC50 = 4.8 nM，Hs746T IC50 = 11.9 nM）,。9y與c-Met的晶體結(jié)構(gòu)（圖3A）顯示其以I型抑制劑的“U型”模式與c-Met結(jié)合,。
圖2. c-Met大環(huán)抑制劑D6808的優(yōu)化過(guò)程（來(lái)源：J. Med. Chem.）
為進(jìn)一步提高細(xì)胞活性，研究人員進(jìn)行了系統(tǒng)的構(gòu)效關(guān)系研究：①為改善化合物溶解性,，同時(shí)考慮到去甲基化是常見(jiàn)的藥物代謝途徑之一,，對(duì)伸向溶劑區(qū)域的N-甲基吡唑進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)替換不同的親水基團(tuán)得到細(xì)胞活性提高的化合物9yj（c-Met IC50 = 5.4 nM, Hs746T IC50 = 9.8 nM）,；②9y與c-Met的晶體結(jié)構(gòu)顯示-CH2CH2-linker呈現(xiàn)“folded”構(gòu)象,，并且與激酶沒(méi)有相互作用，當(dāng)替換為雙鍵,、酰胺等并不能維持活性，猜測(cè)可能破壞了“folded”構(gòu)象,；為了進(jìn)一步避免芐位的代謝不穩(wěn)定性,，將其替換為-CF2CH2-，雖然在激酶水平活性保持（c-Met IC50 = 9.9 nM）,，但細(xì)胞活性略有喪失（Hs746T IC50 = 38.5 nM）,，這說(shuō)明了-CH2CH2-linker對(duì)活性是至關(guān)重要的；③晶體顯示9y的-CH2CH2-linker二面角為76.3°（圖3A）,，對(duì)9y進(jìn)行二面角掃描分析后發(fā)現(xiàn)其在水溶液中存在三種最低能量構(gòu)象“unfolded-i”,、“folded”和“unfolded-ii”（圖3B），對(duì)應(yīng)的二面角分別為-70,、75,、180°，這說(shuō)明抑制劑與蛋白結(jié)合時(shí)會(huì)發(fā)生從“unfolded”到“folded”最低能量構(gòu)象的轉(zhuǎn)換,，因此推測(cè)可以使用大環(huán)化策略將其固定在“folded”的最低能量構(gòu)象以降低結(jié)合時(shí)能量的損失,，最終得到的大環(huán)化合物14（D6808）對(duì)激酶（c-Met IC50 = 2.9 nM）和細(xì)胞抑制活性（Hs746T IC50 = 0.7 nM）均得到提高。D6808與c-Met的晶體結(jié)構(gòu)也顯示-CH2CH2-linker的二面角為75.1°（圖3A）,，大環(huán)策略成功將其固定在“folded”構(gòu)象,，因此活性明顯提高。由此驗(yàn)證了大環(huán)構(gòu)象限制的策略,。
對(duì)活性優(yōu)異的開(kāi)環(huán)化合物9yj（圖3C）與大環(huán)化合物D6808（圖3D）進(jìn)行激酶譜測(cè)試,，顯示化合物D6808比開(kāi)環(huán)化合物9yj具有更好的選擇性，環(huán)合之后降低了對(duì)TRK和AXL的抑制活性,。D6808在Ba/F3-Tpr-Met細(xì)胞中對(duì)于常見(jiàn)的II型抑制劑突變也表現(xiàn)強(qiáng)烈的抑制活性（F1200L/M1250T/H1094Y/F1200I/L1195V IC50 = 4.2, 3.2, 1.0, 39.0和33.4 nM）,，為新型c-Met抑制劑的研究提供新的先導(dǎo)化合物,。
（來(lái)源：J. Med. Chem.）
圖3. A. 化合物9y/ D6808與c-Met的晶體結(jié)構(gòu)疊合。B. 化合物9y在水溶液中的二面角掃描,。C. 化合物9yj激酶譜（373種野生型激酶）,。D. D6808激酶譜（373種野生型激酶）
2. II型TRK大環(huán)抑制劑（Journal of Medicinal Chemistry 2022, 65, 8, 6325-6337）TRK的一代抑制劑larotrectinib和entrectinib在治療NTRK融合陽(yáng)性癌癥方面取得了顯著的臨床療效，但是新出現(xiàn)的獲得性耐藥成為未滿足的臨床需求,，主要有溶劑前沿（SF）突變TRKAG595R和TRKCG623R,，xDFG基序突變TRKAG667C/S和TRKCG696A。因此二代抑制劑selitrectinib和repotrectinib被開(kāi)發(fā)用于第一代TRK抑制劑耐藥的治療,。由于,，第二代抑制劑均為I型的大環(huán)抑制劑，它們對(duì)于SF突變展現(xiàn)出較好的效果,，但是對(duì)xDFG突變卻表現(xiàn)出有限的敏感性,。一些II型多靶點(diǎn)激酶抑制劑，如cabozantinib,、foretinib,、altiratinib和 ponatinib在體內(nèi)外對(duì)xDFG突變模型表現(xiàn)出有效性，但對(duì)SF突變活性一般,，其由于缺乏選擇性,，導(dǎo)致有限的臨床療效和潛在的毒副作用。
基于此,，陸小云研究團(tuán)隊(duì)在早期設(shè)計(jì)的TRK抑制劑5a的基礎(chǔ)上優(yōu)化得到了5b（圖4）,，5b在激酶和細(xì)胞水平對(duì)TRKA/C和 TRKAG667C均顯示納摩爾抑制活性，但對(duì)TRKAG595R抑制活性較弱,。對(duì)接結(jié)果顯示5b的3-氨基哌啶伸向溶劑區(qū)域,，可能會(huì)與突變后的Arg產(chǎn)出空間上的立體位阻，由此猜想可以通過(guò)大環(huán)化的構(gòu)象限制策略以克服SF突變,。在起初合成的大環(huán)化合物6a-6d中,，6d顯示較強(qiáng)的活性（TRKA/ TRKC/ TRKAG667C IC50 = 16.9/ 37.8/ 24.5 nM, Ba/F3-CD74-TRKAG667C IC50 = 20 nM）。但相比于5b,，對(duì)SF突變活性仍然沒(méi)有提高（Ba/F3-CD74-TRKAG595R IC50 = 1.45 μM）,，推測(cè)大環(huán)分子中的哌啶基團(tuán)仍然與突變后的Arg623產(chǎn)生位阻。為提高對(duì)SF突變（Gly to Arg）的抑制活性,，將6d中的氨基哌啶基團(tuán)替換為更小的甲基乙二胺,，設(shè)計(jì)合成了化合物7a-7c，7b和7c在激酶水平都可以維持強(qiáng)抑制活性,，尤其是對(duì)TRKAG595R的活性顯著提高（7b/ 7c IC50 = 493.7/ 80.6 nM）,，其中化合物7b在細(xì)胞水平也顯示出提高的活性（CD74-TRKA/ ETV6-TRKC/ CD74-TRKAG667C/ CD74-TRKAG595R IC50 = 34/ 23/ 6/ 110 nM）。本研究中總計(jì)合成了7個(gè)大環(huán)化合物。
圖4. 基于5b的II型大環(huán)TRK抑制劑的優(yōu)化（來(lái)源：J. Med. Chem.）
共晶結(jié)構(gòu)顯示化合物7b以II型結(jié)合模式與TRKA結(jié)合（圖5A）,，甲基乙二胺距離Gly595的距離約為5.6 ?,，這解釋了對(duì)SF突變TRKAG595R抑制活性提高的原因。7b在373種野生型激酶中也顯示出較好的選擇性（圖5B）,，而且7b在不同融合的Ba/F3細(xì)胞中對(duì)各種xDFG和SF突變顯示出很強(qiáng)的抑制活性（圖5C,，IC50= 1.7 to 55 nM）。據(jù)文獻(xiàn)檢索該類抑制劑是首個(gè)高效大環(huán)II型激酶抑制劑（目前已報(bào)道的大環(huán)類激酶抑制劑均為I型抑制劑）,。
（來(lái)源：J. Med. Chem.）
圖5. A. 化合物7b與TRKA的共晶結(jié)構(gòu),。B. 化合物7b激酶譜（373種野生型激酶）。C. 化合物7b對(duì)xDFG和SF突變?cè)诓煌诤系腂a/F3細(xì)胞中的抗增殖活性（1, larotrectinib,；3, selitrectinib）,。
3. EGFR四代大環(huán)抑制劑（Journal of Medicinal Chemistry 2022, 65, 9, 6840-6858）EGFR是肺癌治療的有效靶點(diǎn)之一。目前,，已有五個(gè)共計(jì)三代小分子抑制劑（一代erlotinib,、gefitinib；二代afatinib,、dacomitinib,；三代osimertinib）被FDA批準(zhǔn)上市。盡管目前EGFR抑制劑在臨床上被廣泛使用,，但仍不可避免出現(xiàn)耐藥,。一代與二代抑制劑一方面不能夠排除對(duì)野生型EGFR的抑制，另一方面在使用后會(huì)出現(xiàn)T790M突變,，從而增加了EGFR對(duì)ATP的親和力，三代抑制劑有效解決了選擇性問(wèn)題,。但是在使用三代抑制劑osimertinib后會(huì)出現(xiàn)797位Cys 突變?yōu)镾er,，使重要的共價(jià)作用喪失，導(dǎo)致進(jìn)一步耐藥,。因此,，迫切需要開(kāi)發(fā)第四代能同時(shí)克服T790M與C797S雙重耐藥突變的EGFR抑制劑。
研究人員通過(guò)分析osimertinib和ALK抑制劑brigatinib（報(bào)道具有EGFRC797S抑制活性）與EGFR的結(jié)合模式,，發(fā)現(xiàn)osimertinib由于喪失了與Cys797的共價(jià)作用而對(duì)EGFRC797S突變體活性降低,，而brigatinib一方面不依賴與Cys797的共價(jià)作用，同時(shí)其磷氧基與Lys745的額外氫鍵相互作用有助于提高對(duì)EGFRC797S的活性,。因此,，同樣先采用優(yōu)勢(shì)片段雜交策略得到化合物17（圖6），其中保留osimertinib中可以實(shí)現(xiàn)EGFRT790M選擇性的吲哚片段,，通過(guò)在吲哚氮上引入磺?；邢騆ys745產(chǎn)生相互作用。對(duì)R2，R3基團(tuán)考察后得到一系列對(duì)突變體選擇性及激酶活性良好的化合物17g（圖7）,，但是這些化合物由于T790M突變體顯著增加的與ATP的親和力,，對(duì)Ba/F3 EGFRLR/TM/CS細(xì)胞表現(xiàn)不佳，需要進(jìn)一步的改造以提高化合物的結(jié)合能力,。
圖6. 使用雜化策略得到新型EGFRC797S抑制劑（來(lái)源：J. Med. Chem.）
化合物17g與EGFRT790M/C797S的晶體結(jié)構(gòu)顯示其嘧啶母核與吲哚基團(tuán)間的二面角為?30.9°,，呈現(xiàn)“unflipped”構(gòu)象（圖7B）。利用量子化學(xué)的方法對(duì)其二面角進(jìn)行掃描（圖7D）,，顯示其存在三種最低能量構(gòu)象,，其中包括兩種“flipped”構(gòu)象，這說(shuō)明分子在與EGFR結(jié)合時(shí)要經(jīng)歷從“flipped”到“unflipped”的構(gòu)象轉(zhuǎn)換,，因此猜測(cè)采用大環(huán)化策略可以將其固定在“unflipped”構(gòu)象從而降低結(jié)合過(guò)程中熵增加導(dǎo)致的結(jié)合自由能損失,。設(shè)計(jì)合成的大環(huán)化合物18c對(duì)EGFRLR/TM/CS具有強(qiáng)抑制活性，其與EGFRT790M/C797S晶體顯示嘧啶母核與吲哚基團(tuán)間的二面角為?29.6°（圖7C）,，并將其固定在“unflipped”構(gòu)象,。但18c仍然對(duì)Ba/F3親本有較強(qiáng)的抑制，前期研究發(fā)現(xiàn)在苯胺的2位取代可以提高選擇性,，因此通過(guò)在2位取代得到了化合物18j,，盡管18j對(duì)EGFRLR/TM/CS抑制活性略有降低，但對(duì)Ba/F3親本抑制顯著減弱,?；衔?strong>18j的細(xì)胞抑制效果和選擇性還在耐藥的腫瘤細(xì)胞得到驗(yàn)證，同時(shí),，也驗(yàn)證了其機(jī)制是通過(guò)阻斷EGFR的磷酸化以及其下游的信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的,。該研究為EGFR四代抑制劑提供新的骨架結(jié)構(gòu)。
（來(lái)源：J. Med. Chem.）
圖7. A. 大環(huán)化合物設(shè)計(jì)策略,。B. 化合物17g與EGFRT790M/C797S晶體結(jié)構(gòu),。C. 化合物18c與EGFRT790M/C797S晶體結(jié)構(gòu)。D. 化合物17g二面角掃描,。
研究課題獲國(guó)家優(yōu)秀青年基金（81922062）,、科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目（2018YFE0105800）、廣東省科技計(jì)劃國(guó)際合作項(xiàng)目（2018A050506043）和暨南大學(xué)資助,。
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