本研究收集到的樣本特征如表1所示,，疾病組嬰兒的Postmenstrual年齡（PMA）（定義為出生時孕周加出生后年齡）為24.9 - 34.2周,，而對照組的嬰兒是25.0 - 36.1周之間,。對照組嬰兒的日齡為6.5-75.1,，病例組嬰兒為2.4-58.2。從嬰兒糞便樣本中共收集了778,612條contigs,，其中40,210條被鑒定為病毒contigs,。

表1 樣本疾病-對照組樣本特征

NEC疾病組中發(fā)病的嬰兒年齡中位數(shù)為31.1周PMA,，有4例嬰兒死亡。與對照組早產(chǎn)兒一樣,，很大一部分病例嬰兒病毒組無法按科水平分類（即未分類病毒）,，可分類的病毒contigs包括噬菌體Myoviridae，Podoviridae和Siphoviridae,，相對豐度中位數(shù)分別為5.6%,、2.7%和2.9%（圖3a）。與對照組一樣,，Microviridae僅在1個樣本中存在較高的相對豐度（55.4%）,，而在其他樣本中相對豐度較低。一些樣本含有屬于Anelloviridae和Circoviridae的真核病毒,。

疾病組樣本中病毒shannon多樣性和豐富度隨著時間的推移在個體之間變化（圖3b）,，但并沒有隨著PMA顯著變化。與對照組嬰兒一樣,，疾病組嬰兒個體內(nèi)的Bray-Curtis相異度顯著小于個體間（圖3c）,。PCoA分析沒有顯示基于PMA的聚類。

進一步通過PCoA比較了疾病組嬰兒和對照組嬰兒的病毒組組成（圖3e）,，疾病組和對照組樣本有明顯重疊,，而PERMANOVA檢測顯示兩組間無顯著差異（P > 0.99）。

圖3 發(fā)生NEC（疾病組）的嬰兒腸道病毒隨時間的變化

本研究通過病例中與NEC發(fā)病時間相關(guān)的病毒進展,，考慮了病毒群落動態(tài)可能影響NEC發(fā)展的可能性,。研究人員設(shè)置一個7d的滑動窗口，窗口間的步長為2d,，從NEC發(fā)生當(dāng)天起反向計數(shù),。發(fā)現(xiàn)疾病組嬰兒之間的Sorensen差異（考慮病毒存在-缺失）在NEC發(fā)病前10天的窗口中下降。在NEC發(fā)生前的這一時期內(nèi),，對照組中匹配樣本之間的差異是穩(wěn)定的,。（圖4a，藍色）,。在NEC前的11-4d,、9-2d和7-0d窗口，疾病組間的差異小于對照組間的差異,。這表明疾病組嬰兒腸道病毒組的beta多樣性在NEC發(fā)病前約10天開始聚集,。

采用LEfSe分析識別NEC發(fā)病前10天期和NEC發(fā)病前11-46天的病毒contigs。結(jié)果確定了NEC發(fā)病前0-10d相關(guān)的137個病毒contigs（NEC相關(guān)的contigs）,，而只有11個病毒contigs與NEC發(fā)病前11 - 46d相關(guān)（圖4b）,。接下來，通過比較NEC相關(guān)contigs的患病率和豐度來驗證鑒別分析,。在NEC前10-25d的病例樣本中識別出NEC相關(guān)的contigs;但是發(fā)病率和平均豐度在NEC發(fā)生前10天顯著增加（圖4c）,。NEC相關(guān)contigs的總體相對豐度較低,，這表明低豐度病毒的變化與NEC病毒體風(fēng)險趨同有關(guān)。

圖4 NEC發(fā)病前的病毒聚集

4. EC發(fā)病前細菌-病毒相互作用

考慮到病毒聚集可能反映了NEC發(fā)病前細菌微生物組的變化的可能性,，因此,，使用了類似的方法來檢查從這些樣本中獲得的細菌測序數(shù)據(jù)。在疾病和對照組中發(fā)現(xiàn)的主要細菌類群包括Gammaproteobacteria,，Clostridia和Bacilli（圖5a）,。不同于病毒beta多樣性，疾病組嬰兒的細菌beta多樣性在NEC發(fā)病前25天是穩(wěn)定的（圖5b）,。在此期間,，疾病組嬰兒樣本的加權(quán)UniFrac距離顯著小于對照組嬰兒樣本，而未加權(quán)UniFrac距離則不顯著（圖5b）,。沒有在疾病組嬰兒樣本中觀察到細菌微生物組的聚集,，可能是因為疾病組細菌beta多樣性在NEC前18-25d已經(jīng)很低了。

最后,，使用線性混合模型研究了病毒組和細菌微生物組之間的相互作用,，以確定病毒和細菌豐度之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,，NEC相關(guān)的病毒contigs在疾病組嬰兒樣本中與特定的細菌屬相關(guān),，但在對照組嬰兒樣本中不遵循相同的相關(guān)模式（圖5c）?？偟膩碚f,，這些結(jié)果表明發(fā)生NEC的病例嬰兒樣本的病毒-細菌相互作用與未發(fā)生NEC的對照組嬰兒樣本有很大的不同。

圖5 NEC發(fā)病前的細菌微生物群穩(wěn)定性和病毒-細菌相互作用

研究結(jié)論

綜上所述,，本研究觀察到,，在沒有親緣關(guān)系的早產(chǎn)兒之間，腸道病毒組在個體間存在顯著差異,，而個體間隨時間的變化顯著較少,。本研究確認了NEC發(fā)病前腸道內(nèi)的病毒和細菌特征。具體來說,，NEC發(fā)病前10天內(nèi)病毒β多樣性趨于減少,，這是由特定的病毒特征驅(qū)動的，并伴隨著特定的病毒-細菌相互作用,。結(jié)果表明,，細菌和病毒的擾動先于NEC的突然發(fā)作,。這些發(fā)現(xiàn)表明,，早產(chǎn)兒的早期生命病毒組特征可能與NEC有關(guān)。

參考文獻

Longitudinal gut virome analysis identifies specific viral signatures that precede necrotizing enterocolitis onset in preterm infants. Nature microbiology, 2022.