既要轉(zhuǎn)錄組測(cè)得了,，又要細(xì)胞活得好

若干年前，有一個(gè)“詭異現(xiàn)象”困惑著攻讀博士學(xué)位的陳萬澤,。他在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡時(shí)經(jīng)常發(fā)現(xiàn),，明明誘導(dǎo)條件和細(xì)胞來源相同，細(xì)胞死亡速度和反應(yīng)卻大不一樣,。這一“詭異現(xiàn)象”似乎說明：那些看起來一樣的細(xì)胞其實(shí)不完全一樣,！

同樣的問題困擾著所有研究單細(xì)胞的科學(xué)家。細(xì)胞從前世到今生的變化蘊(yùn)含了我們生老病死的奧秘:一個(gè)受精卵的今時(shí)昨日就是一次個(gè)體發(fā)育的歷程,；一個(gè)癌細(xì)胞的來龍去脈就是一部腫瘤發(fā)病史,；一個(gè)免疫細(xì)胞的出場謝幕就是一場和病原殊死搏殺的戰(zhàn)爭大戲。所以,，跟蹤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化過程不僅有助于解碼細(xì)胞生命的奧秘,，更有助于揭示疾病發(fā)生的根本原因。

細(xì)胞內(nèi)各個(gè)基因是否表達(dá),、每個(gè)基因表達(dá)量的高低被稱作細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組,，可以很好地體現(xiàn)細(xì)胞的狀態(tài)。2009年湯富酬教授開發(fā)了單細(xì)胞mRNA測(cè)序技術(shù),，可以了解單獨(dú)一個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組來解析細(xì)胞狀態(tài),。

但是普通的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)有一個(gè)局限：需要裂解殺死細(xì)胞獲得所有mRNA才能做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。這就導(dǎo)致了科研人員只能解析某一時(shí)刻的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組,，無法在測(cè)量細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組之后繼續(xù)觀察細(xì)胞的狀態(tài),。以陳萬澤遇到的問題為例：想知道看起來一樣的細(xì)胞哪里不一樣，最好的方法就是知道每個(gè)細(xì)胞在刺激前的轉(zhuǎn)錄組,，再知道刺激后的細(xì)胞反應(yīng)和刺激后的轉(zhuǎn)錄組,。兩相比較就知道了每個(gè)細(xì)胞的差異，以及哪些差異影響了細(xì)胞的反應(yīng),?？墒侨绻诖碳で熬土呀饧?xì)胞收集mRNA，那么細(xì)胞已經(jīng)死亡無法接受刺激；如果在刺激完成后收集mRNA,，則無法收集到刺激前的細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組,，從而陷入“既要確保細(xì)胞活著，又要完成測(cè)序”的死循環(huán),。

從韓家淮院士課題組博士畢業(yè)后,，陳萬澤老師來到了瑞士洛桑聯(lián)邦理工學(xué)院（EPFL）Bart Deplancke課題組做博后，得到了諾貝爾獎(jiǎng)得主Bruce Beutler（先天性免疫受體發(fā)現(xiàn)者諾貝爾獎(jiǎng)得主）的指引：“一個(gè)問題很多人關(guān)心,，就是一個(gè)好問題,；一個(gè)好問題很多人試圖解決都解決不了，就是一個(gè)難題,。好問題值得去解決,，而難題值得用你所有精力去努力”。

陳萬澤決定,，開發(fā)一種能對(duì)活細(xì)胞做轉(zhuǎn)錄組的技術(shù),，要能記錄直徑只有頭發(fā)絲1/1000的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄組的“悲歡離合，電影人生”,。

Live-seq開發(fā)難,，步步逼近路回轉(zhuǎn)

剛開始陳老師想收集細(xì)胞外泌體（細(xì)胞向外面吐出來的小泡，內(nèi)含蛋白質(zhì),、RNA等）做轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,，用外泌體的轉(zhuǎn)錄組來反映細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組。盡管進(jìn)行了細(xì)胞改造,、制備微流控芯片,、大幅優(yōu)化轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程等工作，但是由于細(xì)胞分泌的外泌體數(shù)量少得可憐,，這個(gè)方法最后失敗了,。

左：外泌體示意圖，修改自維基百科,；右：捕獲單細(xì)胞的微流控芯片

得益于EPFL學(xué)科交叉和非常頻繁的學(xué)術(shù)交流,，陳萬澤了解到了材料領(lǐng)域常用但生命科學(xué)領(lǐng)域很小眾的工具——原子力顯微鏡。這種顯微鏡有一個(gè)很尖很尖的硅探針,，多用于檢測(cè)物質(zhì)表面性質(zhì),。陳萬澤將針尖修飾上polyT，用來結(jié)合mRNA的polyA尾巴,，通過polyT和polyA的配對(duì)結(jié)合把mRNA“釣”出來,。由于針尖很細(xì)，對(duì)細(xì)胞的損傷就很小,。這樣既“釣”到了細(xì)胞的mRNA,，又保證了細(xì)胞能繼續(xù)存活,。經(jīng)過嘗試，這個(gè)方法能“釣”到基因,，但是用了大量探針做實(shí)驗(yàn)只有2個(gè)探針有結(jié)果,。雖然有進(jìn)展,，但高度受限于探針的昂貴和低成功率,。

左：原子力顯微鏡原理圖，修改自維基百科,；右：探針修飾polyT示意圖

俗話說得好,，無巧不成書。一次學(xué)術(shù)交流中陳萬澤和導(dǎo)師了解到,，彼時(shí)隔壁瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院的Julia Vorholt實(shí)驗(yàn)室開發(fā)了一種特殊的原子力顯微鏡,，能吸出來一部分細(xì)胞質(zhì)……等會(huì)兒，你是說,，他們實(shí)驗(yàn)室的原子力顯微鏡能吸出來一部分細(xì)胞質(zhì),？

一番電話溝通，雙方一拍即合,。兩個(gè)課題組優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)過程,，包括探針中預(yù)混RNA酶抑制劑、低溫下的快速操作,、超微量樣品轉(zhuǎn)移,、逐樣品清洗避免交叉污染、圖像下追蹤細(xì)胞等措施來保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性,，更巧的是陳萬澤一開始為了外泌體測(cè)序優(yōu)化的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序流程此時(shí)也派上了用場,。

經(jīng)過不斷努力這項(xiàng)新技術(shù)開發(fā)了出來，并最終被命名為——live-seq活細(xì)胞測(cè)序,。

技術(shù)開發(fā)不隨便,，各個(gè)方面要檢驗(yàn)

左圖為實(shí)驗(yàn)示意圖，右圖為實(shí)拍顯微鏡吸取細(xì)胞質(zhì)（論文作者供圖）

技術(shù)開發(fā)出來必然要接受一系列的質(zhì)問和考驗(yàn)：

普通單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以描述不同細(xì)胞狀態(tài),，你live-seq能準(zhǔn)確描述出不同細(xì)胞的類型和狀態(tài)嗎,？

能！聯(lián)合課題組用live-seq測(cè)了五種狀態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組,，一共檢測(cè)了294個(gè)細(xì)胞,，平均每個(gè)細(xì)胞檢測(cè)到約4112個(gè)基因的表達(dá)，與常規(guī)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組方法檢測(cè)到的基因數(shù)量接近,。live-seq轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)能夠清晰地將五種細(xì)胞分開,，說明live-seq測(cè)到的轉(zhuǎn)錄組能有效區(qū)分不同類型的細(xì)胞。

live-seq能有效區(qū)分不同的細(xì)胞（論文作者供圖）

普通單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組可以描述整個(gè)細(xì)胞狀態(tài),，你live-seq吸出來的這一部分能代表整個(gè)細(xì)胞嗎,？

能,！課題組將live-seq測(cè)到的數(shù)據(jù)和整個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組相比較，發(fā)現(xiàn)二者沒有顯著的區(qū)別,，說明live-seq測(cè)到的數(shù)據(jù)能有效代表整個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組,。

live-seq和完整細(xì)胞的測(cè)序數(shù)據(jù)一致（論文作者供圖）

開發(fā)live-seq是為了讓細(xì)胞測(cè)序完還能存活的，你live-seq能保證細(xì)胞被吸取了一部分細(xì)胞質(zhì)還存活嗎,？

能,！live-seq平均每次吸取的細(xì)胞質(zhì)只有1.1 pL，吸取后的細(xì)胞存活率在85%-89%,，要知道細(xì)胞傳代時(shí)胰蛋白酶解離后的細(xì)胞存活率也才90-95%,。課題組還比較了不吸取細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞、吸取細(xì)胞質(zhì)后1小時(shí)的細(xì)胞,、吸取4小時(shí)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組,，三者一致，說明live-seq沒有對(duì)細(xì)胞造成很大的影響,。并且在顯微鏡下,，課題組能觀察到吸取過細(xì)胞質(zhì)后，細(xì)胞體積可以快速恢復(fù)到正常水平,，還能正常分裂,，更說明不影響細(xì)胞存活。

吸取細(xì)胞質(zhì)不會(huì)對(duì)影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組（論文作者供圖）

live-seq之后細(xì)胞仍能正常生長,、分裂（論文作者供圖）

開發(fā)新技術(shù)是為了解決實(shí)際問題,，你live-seq能解決實(shí)際問題嗎？

能,！而且立刻顯現(xiàn)出不俗的實(shí)力,。Live-seq能夠先測(cè)量“過去”的細(xì)胞作為細(xì)胞變化的“因”，讓細(xì)胞存活一段時(shí)間后,，再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序作為細(xì)胞變化的“果”,。能夠同時(shí)呈現(xiàn)因果是Live-seq的重要特點(diǎn)。作為牛刀小試,，聯(lián)合課題組采用了RAW-G9巨噬細(xì)胞系模型,，其中包含一條神奇的通路：當(dāng)使用LPS刺激，細(xì)胞中的NF-κB表達(dá)量上升,，NF-κB的上升會(huì)同時(shí)刺激Tnf-mCherry和NFKBIA的上升,，但是NFKBIA的上升會(huì)抑制NF-κB。

LPS-NF-κB通路關(guān)系,，紅色箭頭代表促進(jìn)作用,，藍(lán)色線條代表抑制作用

使用傳統(tǒng)的單細(xì)胞測(cè)序，只能暫停到細(xì)胞裂解的那個(gè)時(shí)刻,，在這一時(shí)刻因?yàn)镹F-κB的調(diào)控,，Tnf-mCherry和NFKBIA要么同時(shí)高要么同時(shí)低,；但是當(dāng)使用live-seq觀察的時(shí)候，NFKBIA表達(dá)量升高會(huì)導(dǎo)致Tnf-mCherry表達(dá)量下降,，這是傳統(tǒng)單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)無論如何也觀察不到的,。這種奇妙的感覺就像Michael Jackson的“太空舞步”，暫停下來每一幀都好像在向前走,，但是當(dāng)你連貫起來看卻發(fā)現(xiàn)人在后退,！這一次live-seq完勝。

研究成果想要炫,，學(xué)科交叉說了算

回顧live-seq的開發(fā)過程,，學(xué)科交叉顯得尤為重要,，優(yōu)化超微量RNA的測(cè)序步驟需要扎實(shí)的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)功底,，大批的數(shù)據(jù)分析需要生物信息的能力，更不要提原子力顯微鏡的使用需要跨到材料領(lǐng)域?qū)W習(xí),。這其中任何一項(xiàng)的缺失都會(huì)導(dǎo)致這項(xiàng)技術(shù)的開發(fā)失敗,，陳老師講述中課題組之間的合作早就不是各自分工，而更像武俠小說里身負(fù)多項(xiàng)絕學(xué)后洗練招式的融會(huì)貫通,。

學(xué)科交叉的魅力又不局限于本篇研究?，F(xiàn)代科學(xué)在研究自然界的時(shí)候劃分了很多學(xué)科，然而自然界原本就是一個(gè)相互聯(lián)系的有機(jī)整體,?？茖W(xué)交叉集分化與綜合于一體，實(shí)現(xiàn)了科學(xué)的整體化,。既是還原了自然本來面目,，也是發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的新戰(zhàn)場,，更有利于解決人類面臨的復(fù)雜科學(xué)問題,。

以上的研究經(jīng)歷和研究結(jié)果是2022年8月17日，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所陳萬澤課題組,、瑞士洛桑聯(lián)邦理工（EPFL）Bart Deplancke課題組和蘇黎世聯(lián)邦理工（ETHZ）Julia Vorholt課題組合作在Nature發(fā)表的題為 Genome-wide molecular recording using Live-seq 的文章,，該研究開創(chuàng)了一種利用原子力顯微鏡對(duì)活細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組做測(cè)序的方法，可以將scRNA-seq從終點(diǎn)分析轉(zhuǎn)換為時(shí)間分析來解決廣泛的生物學(xué)問題,。

論文鏈接：
https://www./articles/s41586-022-05046-9

DOI: 10.1038/s41586-022-05046-9