【原】J HEMATOL ONCOL | 自然殺傷細(xì)胞在癌癥治療中的作用

干細(xì)胞與外泌體 2022-07-27 發(fā)布于廣東

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自然殺傷 (NK) 細(xì)胞是一種特殊的免疫效應(yīng)細(xì)胞類型，在針對(duì)異常細(xì)胞的免疫激活中起關(guān)鍵作用,。與 T 細(xì)胞激活所需的事件不同,，NK 細(xì)胞激活受 NK 受體與靶細(xì)胞的相互作用控制，獨(dú)立于抗原加工和呈遞,。由于相對(duì)簡單的激活線索,，NK細(xì)胞在癌癥免疫治療領(lǐng)域獲得了極大的關(guān)注。許多努力正在開發(fā)和設(shè)計(jì)基于 NK 細(xì)胞的癌癥免疫療法,。

自然殺傷 (NK) 細(xì)胞是腫瘤免疫監(jiān)視的重要組成部分，在小鼠模型和臨床研究中,，隨著 NK 活性降低,，癌癥易感性和轉(zhuǎn)移性更高，這證明了這一點(diǎn),。使用一系列生殖系編碼的表面受體,，NK 細(xì)胞能夠識(shí)別惡性細(xì)胞并迅速對(duì)其采取行動(dòng)，而無需事先致敏,。激活后,，NK 細(xì)胞釋放含有穿孔素和顆粒酶的細(xì)胞毒性顆粒，以與激活的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞類似的方式直接裂解腫瘤細(xì)胞,。

NK 細(xì)胞也是趨化因子和細(xì)胞因子的有效生產(chǎn)者,，例如干擾素 γ (IFN-γ) 和腫瘤壞死因子 α (TNF-α)，因此在調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)中必不可少,。由于它們具有消除腫瘤細(xì)胞的先天能力,，基于 NK 細(xì)胞的癌癥免疫療法已被研究了數(shù)十年。早期臨床試驗(yàn)已證明 NK 細(xì)胞輸注的總體安全性,，即使在同種異體環(huán)境中也是如此,。

NK細(xì)胞的生物學(xué)功能

四十多年前，NK 細(xì)胞被鑒定為淋巴細(xì)胞,，具有溶解腫瘤細(xì)胞的先天能力,，無需事先致敏。NK 細(xì)胞可以通過釋放含有顆粒酶和穿孔素的細(xì)胞毒性顆粒以及通過死亡受體介導(dǎo)的途徑（例如 FasL/Fas）來觸發(fā)靶細(xì)胞死亡,。NK 細(xì)胞還通過分泌趨化因子和細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,，例如 RANTES 和 IFN-γ。

在人類中,，傳統(tǒng)上通過流式細(xì)胞術(shù)表征的 NK 細(xì)胞表面不存在 CD3 和存在 CD56 來識(shí)別 NK 細(xì)胞,。在小鼠中，CD3 的缺乏和 NK1.1 的存在是區(qū)分 NK 細(xì)胞的典型標(biāo)準(zhǔn),。在缺乏 NK1.1 表達(dá)的小鼠品系（例如 BALB/c）中,，CD49b 用于鑒定 NK 細(xì)胞。

自然殺傷 (NK) 細(xì)胞與癌細(xì)胞

天然細(xì)胞毒性受體 NKp46 也常用于在 CD3 表達(dá)缺失的情況下識(shí)別小鼠和人類 NK 細(xì)胞,。值得注意的是,，某些組織（如粘膜屏障）擁有最近發(fā)現(xiàn)的先天淋巴細(xì)胞 (ILC) 的子集,，這些細(xì)胞也共享 NK 細(xì)胞的典型標(biāo)志物。例如,，分泌人類 ILC3 的 IL-22 子集是 CD56+NKp46+CD3,。其他標(biāo)記，例如缺少 c-kit,，可用于區(qū)分人類 NK (c-kit-) 和 ILC3s (c-kit +),。在小鼠中，NK 和 ILC1 是 NK1.1+CD3-,，但可以通過 CD49a 和 Eomes 表達(dá)進(jìn)一步表征,。NK 細(xì)胞是 CD49a-Eomes+，而 ILC1s 是 CD49a+Eomes,。

NK 細(xì)胞存在于血液中,，占循環(huán)淋巴細(xì)胞的 5%-15%，也存在于各種淋巴和非淋巴器官,，如脾,、肺和肝臟。根據(jù)外周血 NK 細(xì)胞的特征,，人類 NK 細(xì)胞通常被細(xì)分為兩個(gè)主要亞群：CD56brightCD16dim/? 和 CD56dimCD16+,，傳統(tǒng)上認(rèn)為前者不太成熟并且是有效的細(xì)胞因子生產(chǎn)者，而后者更加成熟和最具細(xì)胞毒性,。

血液中的大多數(shù) NK 細(xì)胞是 CD56dim,，而 CD56bright 亞群僅占總循環(huán) NK 細(xì)胞的不到 15%。CD56bright 和 CD56dim NK 細(xì)胞在組織中的相對(duì)比例可能與在外周血中觀察到的非常不同,。值得注意的是,，許多組織駐留的 NK 亞群現(xiàn)在被證明在表型和功能上與傳統(tǒng)的外周血 NK 細(xì)胞不同。例如,，在孕早期構(gòu)成子宮內(nèi)淋巴細(xì)胞的大部分的子宮 NK 細(xì)胞是 CD56 超亮細(xì)胞,，通過調(diào)節(jié)胎盤血管重塑在妊娠中發(fā)揮重要作用,。

NK 細(xì)胞來源于 CD34+ 造血干細(xì)胞,。骨髓被認(rèn)為是NK發(fā)育的主要部位。最近的證據(jù)表明,，NK 細(xì)胞也可以在次級(jí)淋巴器官中發(fā)育和成熟,，包括扁桃體、脾臟和淋巴結(jié),。NK 細(xì)胞祖細(xì)胞經(jīng)歷不同的發(fā)育階段,，逐漸獲得定義 NK 細(xì)胞身份的表面受體的表達(dá)，如 NK1.1 和 CD56 和/或調(diào)節(jié)其效應(yīng)子功能,，如 CD16 和 NKp46,。

基于NK細(xì)胞的癌癥免疫療法的臨床研究

當(dāng)前基于 NK 細(xì)胞療法的臨床前開發(fā)很大程度上受到早期臨床研究的啟發(fā),。隨著對(duì) NK 細(xì)胞如何被激活的了解，最初的基于 NK 細(xì)胞的療法在造血干細(xì)胞移植 (HSCT) 的臨床環(huán)境中處于領(lǐng)先地位,，由此證明 NK 細(xì)胞具有發(fā)揮移植物抗白血病作用的能力,。

研究表明，KIR 不匹配的同種異體反應(yīng)性供體 NK 細(xì)胞保護(hù)骨髓移植的 AML 患者免于 AML 復(fù)發(fā),，同時(shí)避免移植物抗宿主病 (GVHD) ,。在高劑量環(huán)磷酰胺和氟達(dá)拉濱的預(yù)處理方案后,，輸注來自 HLA 半相合供體的 NK 細(xì)胞結(jié)合皮下注射 IL-2 導(dǎo)致供體 NK 細(xì)胞在體內(nèi)成功擴(kuò)增并誘導(dǎo) 519 名預(yù)后不良的急性髓系白血病 (AML) 患者,。進(jìn)一步研究表明有效的淋巴去除預(yù)處理對(duì)體內(nèi) NK 細(xì)胞擴(kuò)增和持久性的影響，因?yàn)榻邮茌^弱預(yù)處理的患者未能展示 NK 細(xì)胞植入。目前認(rèn)為,，過繼轉(zhuǎn)移的成功需要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)淋巴細(xì)胞減少的環(huán)境,，為供體細(xì)胞的生存和增殖提供一個(gè)生態(tài)位。

CAR-NK細(xì)胞作為CAR-T療法的替代品

配備 CAR 的 T 細(xì)胞已被證明可為患有特定液體癌癥的患者提供臨床益處。兩種靶向 CD19 的 CAR-T 產(chǎn)品被 FDA 批準(zhǔn)用于治療 B 細(xì)胞淋巴瘤和急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。然而,，CAR-T 療法有兩個(gè)主要挑戰(zhàn)：(i) 需要足夠長的時(shí)間來產(chǎn)生治療劑量的自體 CAR-T 細(xì)胞,，這限制了其治療快速進(jìn)展疾病患者的可行性,；(ii) 難以從大量預(yù)處理且經(jīng)常淋巴細(xì)胞減少的癌癥患者中獲得足夠數(shù)量的自體 T 細(xì)胞用于 CAR-T 細(xì)胞生成,。

作為 CAR-T 細(xì)胞療法的替代方案，CAR-NK 細(xì)胞療法不僅可以規(guī)避這些挑戰(zhàn),，而且還具有其他主要優(yōu)勢：(i) 能夠使用無限的同種異體 NK 源而無需擔(dān)心 GVHD [6, 31, 32],；(ii) 用 NK 細(xì)胞系或 iPSC-NK 產(chǎn)生“現(xiàn)成”產(chǎn)品的潛力 [37,38,39,40,41],；(iii) 生產(chǎn)時(shí)間相對(duì)縮短；iv) 通過獨(dú)立于 CAR 工程的 NK 細(xì)胞天然受體識(shí)別和殺死腫瘤細(xì)胞，不太可能通過下調(diào) CAR 抗原而使疾病逃脫,，如 CAR-T 細(xì)胞療法所示,。

用于臨床的 NK 擴(kuò)增

保留細(xì)胞毒活性的 NK 細(xì)胞的來源和臨床規(guī)模擴(kuò)增是開發(fā)臨床規(guī)模 NK 細(xì)胞療法的主要挑戰(zhàn),。目前，策略因臨床環(huán)境和細(xì)胞來源而異,。新鮮分離,、活化或體外擴(kuò)增的 NK 細(xì)胞群顯示出表型和功能差異。差異還源于激活方法,，例如白介素的選擇,、它們的組合、飼養(yǎng)細(xì)胞的類型以及其他一些因素,。

供體來源的 NK 來源

供體NK細(xì)胞的主要來源是采集的外周血,。在與細(xì)胞因子短暫孵育過夜后,，使用同種異體 NK 進(jìn)行無擴(kuò)增的過繼轉(zhuǎn)移已被證明足以激活 NK 細(xì)胞并增強(qiáng)它們對(duì)腫瘤靶標(biāo)的細(xì)胞毒性。然而,，用于治療的 NK 細(xì)胞的劑量是有限的,。隨著活化和擴(kuò)增方法的改進(jìn),，制備越來越高劑量的 NK 細(xì)胞用于從單供體靜脈切開術(shù)進(jìn)行過繼轉(zhuǎn)移變得可能,。

為了避免嚴(yán)重的副作用，例如同種異體反應(yīng)性 T 細(xì)胞引起的 GVHD或供體來源的 B 細(xì)胞引起的過客淋巴細(xì)胞綜合征,，建議在擴(kuò)增前對(duì)同種異體 NK 細(xì)胞進(jìn)行純化以限制污染總 T細(xì)胞小于 1–5 × 105/Kg,。NK 細(xì)胞的純化通常通過 CD3 表達(dá)細(xì)胞的磁耗竭和隨后 CD56 表達(dá)細(xì)胞的富集或通過熒光激活細(xì)胞分選來實(shí)現(xiàn)。

臍帶血 (UCB)或胎盤代表了其他顯著的 NK 細(xì)胞來源,，已被用于臨床應(yīng)用,。UCB 和胎盤衍生細(xì)胞都含有一定比例的 NK 細(xì)胞祖細(xì)胞，這些祖細(xì)胞能夠在成熟和擴(kuò)增階段分化為 NK 細(xì)胞,。通常,，一劑 UCB 或胎盤供體可以消耗到足以進(jìn)行一次過繼轉(zhuǎn)移程序的量,。例如，胎盤分離 NK 的 21 天 NK 培養(yǎng)產(chǎn)生平均 1.2 × 109 個(gè) NK 細(xì)胞,，存活率約為 80% [106] 和 1.59 × 1010 個(gè) NK 細(xì)胞，平均純度為 92.37% 來自 UCB,。

iPSC-NK 細(xì)胞來源

供體來源的 NK 細(xì)胞具有一定的局限性,，主要是因?yàn)樗鼈冊(cè)诠δ苣芰蛿U(kuò)增潛力方面存在差異。在臨床環(huán)境中,，每個(gè)批次都需要驗(yàn)證,，這會(huì)導(dǎo)致患者接受輸注之前的額外延遲時(shí)間。此外,，受限的擴(kuò)增能力為通過基因工程提高 NK 細(xì)胞的功效帶來了困難,。CAR-NK 是開發(fā)中克服這一限制的方法之一。使用易于擴(kuò)展至大劑量的改良NK細(xì)胞系CAR-NK92的方法已進(jìn)入臨床試驗(yàn),。然而,，NK92 是一種轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，具有與其致瘤性質(zhì)和細(xì)胞遺傳學(xué)異常相關(guān)的局限性,，因此臨床使用需要輻照,，這限制了其壽命活動(dòng)。

一種新的 NK 細(xì)胞來源已經(jīng)出現(xiàn),，以規(guī)避與 NK 細(xì)胞治療相關(guān)的許多挑戰(zhàn),。它是 iPSC 分化的 NK 細(xì)胞 (iPSC-NK)。從概念上講,，iPSC-NK 可以提供同質(zhì)分化的 NK 細(xì)胞群,，可以作為“現(xiàn)貨供應(yīng)”擴(kuò)展到臨床規(guī)模，克服 NK-92 細(xì)胞系的局限性,。

幾個(gè)小組已經(jīng)證明了從人類胚胎干細(xì)胞 (hESCs) 和 iPSCs 體外衍生出功能性 NK 細(xì)胞,。通常，分化是在胚狀體中或通過 OP9 小鼠基質(zhì)共培養(yǎng)誘導(dǎo)的,。最近,，還在貼壁單層培養(yǎng)物中建立了分化方法。貼壁條件的優(yōu)勢在于它為優(yōu)化分化提供了明確的環(huán)境,。與僅產(chǎn)生高達(dá) 4% 的 CD34+ 的其他方法相比,，該方法實(shí)現(xiàn)了超過 15% 的 CD34+ 造血祖細(xì)胞。這項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)為臨床規(guī)模的 NK 細(xì)胞生產(chǎn)提供了一個(gè)全新的框架,，允許在多能細(xì)胞狀態(tài)下進(jìn)行基因修飾和無限擴(kuò)增,。

CAR 改造的 iPSC-NK 細(xì)胞已經(jīng)在臨床前研究中證明其在靶向人類腫瘤方面的有效性 [41]。iPSC-NK 細(xì)胞技術(shù)的另一個(gè)重要特征是能夠操縱分化策略,，從而塑造所得產(chǎn)品的表型和功能,。例如,，用 GSK3b 抑制劑增強(qiáng) Wnt 信號(hào)通路誘導(dǎo)最終造血在這種條件下發(fā)育的 NK 細(xì)胞具有更明顯的炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生表型，而 Wnt 獨(dú)立的 NK 亞群,，類似于原代胎兒 NK 細(xì)胞,，形成了一個(gè)增加細(xì)胞毒性的偏見。這種改變分化過程的能力為探索 NK 細(xì)胞的常駐或器官特異性表型提供了可能,。

誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）的高增殖能力允許引入各種遺傳修飾和用于治療一系列疾病的現(xiàn)成單倍型特異性細(xì)胞的開發(fā)資源庫,。有許多正在進(jìn)行的使用工程化 iPSC-NK 細(xì)胞進(jìn)行癌癥免疫治療的臨床試驗(yàn)。

基于NK細(xì)胞的癌癥治療的臨床開發(fā)

“現(xiàn)成” NK 細(xì)胞治療產(chǎn)品 oNKord,，來自 UCB-CD34+ 祖細(xì)胞的同種異體部分 HLA 匹配 NK 細(xì)胞,，已獲得 EMA 和 FDA 的孤兒藥指定，用于治療不符合同種異體干細(xì)胞移植資格的 AML 患者.該批準(zhǔn)基于臨床研究,，證明 oNKord 在第 1 年將生存率提高了 80%,，而對(duì)照組則為 35%。

近日,，F(xiàn)DA 批準(zhǔn)了使用胎盤擴(kuò)增 NK 細(xì)胞（CYNK-001）治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）的研究新藥（IND）,。這一成功鼓勵(lì)了許多正在進(jìn)行的基于 NK 細(xì)胞的癌癥治療的臨床研究，單獨(dú)或與其他方案相結(jié)合,。Clinicaltrials.gov 目前列出了 100 多項(xiàng)基于 NK 細(xì)胞的癌癥免疫療法的臨床試驗(yàn),。在此，我們重點(diǎn)介紹了當(dāng)前對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤的評(píng)估,。

基于 NK 細(xì)胞的血液系統(tǒng)惡性腫瘤臨床試驗(yàn)

同種異體或自體供體來源的 NK 細(xì)胞療法用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤（如 AML）的安全性和有效性已得到充分證實(shí),。隨著不斷努力改善治療反應(yīng)和產(chǎn)生更可行的 NK 細(xì)胞臨床規(guī)模的新方法，正在設(shè)計(jì)新興的臨床試驗(yàn)來評(píng)估這些新模式并擴(kuò)大其適應(yīng)癥,。

在 3 名復(fù)發(fā)或難治性 AML 患者中對(duì) CAR NK-92 細(xì)胞進(jìn)行的首次人體臨床試驗(yàn)表明,，CAR NK-92 可以以每名患者高達(dá) 50 億個(gè)細(xì)胞的劑量輸注，而不會(huì)引起顯著的不良反應(yīng) [149],。臍帶血衍生的 CD19 靶向 CAR-NK 治療復(fù)發(fā)或難治性 CD19+ 癌癥患者的 I/II 期試驗(yàn)正在進(jìn)行中 (NCT03056339),。中期結(jié)果顯示，11 名患者中有 8 名對(duì)治療有客觀反應(yīng),，而沒有出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng),。

基于 NK 細(xì)胞的實(shí)體瘤臨床試驗(yàn)

有大量關(guān)于 NK 細(xì)胞免疫療法治療實(shí)體瘤的臨床試驗(yàn)。例如,，正在進(jìn)行一項(xiàng) 2 期臨床試驗(yàn),，以評(píng)估人類 HLA 半相合造血細(xì)胞移植 (HCT) 以及移植后早期輸注供體 NK 細(xì)胞 (NCT02100891) 的安全性和有效性。

研究對(duì)象為高危實(shí)體瘤患者,，包括尤文肉瘤,、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、橫紋肌肉瘤,、骨肉瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,。還有許多正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在評(píng)估靶向腫瘤的 CAR-NK 細(xì)胞的安全性和有效性,，包括使用 HER2 特異性 CAR-NK 細(xì)胞治療晚期或轉(zhuǎn)移性 HER2 表達(dá)實(shí)體瘤（NCT04319757）、ROBO1 特異性 CAR-NK 細(xì)胞NK 細(xì)胞治療廣譜實(shí)體瘤 (NCT03940820),，以及 MUC1 特異性 CAR-pNK 治療 MUC1 陽性復(fù)發(fā)或難治性實(shí)體瘤患者 (NCT02839954),。

MUC1 特異性 CAR-pNK 療法在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)和移植物抗宿主病方面表現(xiàn)出良好的安全性和初步療效。有許多正在進(jìn)行的臨床試驗(yàn)正在探索基于 NK 的療法與其他方式相結(jié)合的安全性和有效性,。正在進(jìn)行 I/II 期臨床試驗(yàn),，以評(píng)估 NK 細(xì)胞聯(lián)合尼妥珠單抗治療晚期惡性腫瘤（NCT03554889）和 NK 細(xì)胞輸注多線治療后晚期惡性腫瘤患者的安全性和有效性（NCT03619954）。

結(jié)論

NK 細(xì)胞代表了一種專門的免疫效應(yīng)細(xì)胞群,，具有快速作用和有效的抗腫瘤能力,。十年前,，針對(duì)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的開創(chuàng)性臨床研究證實(shí)了過繼性 NK 細(xì)胞癌癥免疫療法的概念,。獲得大量 NK 細(xì)胞、體外擴(kuò)展到臨床規(guī)模以及維持輸注 NK 細(xì)胞的體內(nèi)存活和活性的困難阻礙了進(jìn)展,。隨著 iPSC-NK 和基因工程方法的新工具以及對(duì) NK 細(xì)胞生物學(xué)的新理解,，是時(shí)候重新探索 NK 細(xì)胞的治療潛力了。盡管存在挑戰(zhàn),，但目前已獲批的基于 NK 細(xì)胞的療法和新興的臨床前和臨床研究吸引了人們的目光,。