了解腫瘤異質(zhì)性——腫瘤內(nèi)細胞間的分子變異——有望解決癌癥生物學中的突出問題,，并改善特定癌癥亞型的診斷和治療,。近日，來自澳大利亞的科研團隊在《Nature Methods》發(fā)表綜述文章,，總結(jié)了空間技術(shù)在腫瘤研究中的應用,，并討論了目前的方法和未來的機會，以計算整合這些模式實現(xiàn)對腫瘤生物學的綜合評估,。

空間癌癥生物學領(lǐng)域的突出問題

空間技術(shù)在腫瘤研究中的應用

研究團隊總結(jié)了三個主要領(lǐng)域：（1）用于跟蹤癌癥亞克隆和腫瘤結(jié)構(gòu)變化的光學條形碼方法,；（2）用于檢測特定生物標記物的空間蛋白質(zhì)組學方法；（3）用于探索腫瘤及其微環(huán)境中細胞的空間轉(zhuǎn)錄組學方法,。

克隆,、空間轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學方法時間表  

傳統(tǒng)上，通過使用DNA和RNA測序來探索癌癥在亞克隆分辨率下的進化進程（包括一群細胞的混合測序和最近使用的單細胞測序）,。雖然在測序前對腫瘤進行顯微切割和分割,，提供了關(guān)于亞克隆在其微環(huán)境中的三維（3D）分布信息，但越來越需要基于單細胞分辨率的成像方法來觀察克隆的相互作用,。

這些熒光光學條碼技術(shù)（又稱多色克隆譜系追蹤）使用多個熒光報告因子的隨機和多重表達來識別和追蹤眾多亞克隆,。兩種主要方法涉及（1）隨機和組合表達轉(zhuǎn)基因的體內(nèi)表達（轉(zhuǎn)基因模型例如在Confetti小鼠中）或（2）在移植到受體小鼠之前，對癌細胞進行體內(nèi)慢病毒感染以表達不同的熒光蛋白（異位模型例如使用LeGO載體）,。通過這些轉(zhuǎn)基因的構(gòu)成性或誘導性表達,，熒光細胞及其后代的時空命運在特定器官或整個動物中被縱向研究。雖然光學譜系追蹤方法可直接顯示體內(nèi)克隆性癌癥的異質(zhì)性,，但可識別顏色的數(shù)量以及可追蹤的亞克隆數(shù)量是有限的,。

使用LeGO載體異位表達多種熒光蛋白，可以在各種細胞類型和物種中進行譜系追蹤

光學條形碼技術(shù)的最大優(yōu)勢在于進行活細胞和活體成像,，并獲取單個細胞及其所屬亞克隆的動態(tài)信息,。為了充分利用這一優(yōu)勢，必須在體內(nèi)3D組織環(huán)境中的特定細胞與其分子組成之間建立直接聯(lián)系,。雖然光學標簽有助于在分子分析之前通過流式細胞術(shù)對條形碼細胞進行分類,，但這需要細胞分離，從而導致單個細胞的準確組織位置丟失,。為了將亞克隆的三維可視化與有意義的分子信息聯(lián)系起來,，將原位可視化與空間轉(zhuǎn)錄組學或蛋白質(zhì)組學技術(shù)相結(jié)合的方法將在發(fā)現(xiàn)癌癥亞克隆行為的新調(diào)節(jié)因子方面具有非常重要的價值。

組織學分析對于腫瘤的定性至關(guān)重要,。病理學家通常使用蘇木精和伊紅（H&E）染色來進行診斷和預后,。雖然僅根據(jù)H&E進行腫瘤分類的深度學習模型的開發(fā)成本很低，而且可以進一步利用這一信息,，但這些方法提供的腫瘤和TME的概況信息有限,。隨著對腫瘤異質(zhì)性和TME中細胞多樣性認識的增加，增加空間上可分辨的蛋白質(zhì)數(shù)量的需求也在增加。免疫熒光通?？梢栽谝粋€完整的組織切片內(nèi)對四或五個蛋白質(zhì)目標進行多重檢測,。然而，最近的方法能夠評估幾十種蛋白質(zhì)標記物,，并能提供一個更全面的腫瘤及其微環(huán)境圖譜,。這些方法涉及抗體染色和檢測的連續(xù)循環(huán),，使用元素同位素結(jié)合抗體池或使用熒光顯微鏡或DNA測序檢測的DNA條形碼抗體進行染色,。

空間蛋白質(zhì)組學方法

研究團隊在文中展示了一些新興技術(shù)的選擇（所有方法都需要對特定的抗體組合進行優(yōu)化，同時要考慮到組織的類型和質(zhì)量）,。

> 迭代方法通過使用連續(xù)幾輪的抗體或標簽檢測來增加蛋白質(zhì)目標的數(shù)量,，例如mIHC、OPAL,；其他方法通過更溫和地去除或剝離抗體標簽而不是抗體本身來減少循環(huán)對組織完整性的影響,，例如cycIF、REAdye_lease技術(shù),；其他迭代方法使用一組與DNA條形碼結(jié)合的初級抗體進行單步染色,，例如CODEX。

基于熒光的方法提供高分辨率的空間信息,，但光譜重疊限制了可以同時成像的熒光團的數(shù)量,。使用非熒光的方法（例如質(zhì)譜和測序）避免了這個問題，并且可以在一個染色和掃描步驟中測量多達100種蛋白質(zhì),。

> 基于質(zhì)譜技術(shù)的免疫檢測,。飛行時間（TOF）質(zhì)譜技術(shù)可以檢測與穩(wěn)定金屬同位素結(jié)合的抗體。與基于熒光的方法相比,，檢測器的質(zhì)量分辨率允許同時檢測幾十個金屬標簽而不受干擾,。飛行時間質(zhì)譜流式細胞術(shù)（CyTOF）基于這種形式的免疫檢測，能夠?qū)Χ鄠€參數(shù)進行單細胞分析,。IMC使用與CyTOF相同的TOF讀數(shù),，結(jié)合高能量、短波長的激光束進行組織消融,，聚焦到直徑為1μm的光斑大小,。類似的方法使用聚焦離子束和二次離子質(zhì)譜來實現(xiàn)更高的分辨率和靈敏度。與IMC相比,，MIBI可以在FFPE組織中成像40多種蛋白質(zhì),。IMC或MIBI掃描組織區(qū)域的時間比循環(huán)方法長。然而,，不需要進行抗體染色和成像周期（如mIHC或OPAL）或重復DNA雜交輪次（如CODEX）,。

> 基于測序的免疫檢測。蛋白質(zhì)和RNA的多重數(shù)字空間分析（DSP）利用寡核苷酸結(jié)合的抗體，使用 NanoString nCounter 時,，DSP可以同時檢測至少20~100種蛋白質(zhì),，并可能對 RNA、DNA 和蛋白質(zhì)進行多達800-plex的檢測,，使用高通量測序時甚至可以進行更高的多重檢測,。盡管分辨率有限（最近空間分子成像儀平臺有所改進），DSP已成功用于研究轉(zhuǎn)移性前列腺癌的腫瘤異質(zhì)性,。

單細胞分辨率下的多重蛋白質(zhì)檢測為定義腫瘤異質(zhì)性和TME的復雜性提供了新的機會,。基于蛋白質(zhì)的技術(shù)是非常寶貴的,，因為它們提供了一個直接的功能信息測量,。這些技術(shù)的進一步完善和商業(yè)化將提高通量（如已經(jīng)出現(xiàn)的自動染色機和玻片掃描儀），并實現(xiàn)更好的亞細胞分辨率和三維成像,。然而,，腫瘤細胞固有的可塑性導致了一系列的細胞亞型和狀態(tài)，只有與健康組織相比,，通過廣泛的標記物分析才能確定,。空間轉(zhuǎn)錄組方法為蛋白質(zhì)組分析提供了補充數(shù)據(jù)，獲得了關(guān)于腫瘤復雜性的綜合視角,。

研究團隊從基于FISH和基于測序兩方面介紹了空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù),。

基于FISH的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)詳細解讀：??從全標本到單細胞空間組，基因表達實現(xiàn)“3D”分析,；空間轉(zhuǎn)錄組是一種怎樣的轉(zhuǎn)錄組,？；科研“出圈”必備——空間組學技術(shù)

多模態(tài)空間數(shù)據(jù)的整合分析  

空間技術(shù)已產(chǎn)生高度多重化和多模態(tài)的數(shù)據(jù),。在過去五年中,，空間軟件程序生態(tài)系統(tǒng)得到了快速發(fā)展，以分析具有12個常見分析類別的空間組學和成像數(shù)據(jù),。

空間成像,、測序數(shù)據(jù)分析和數(shù)據(jù)集成方法概覽

整合成像和測序數(shù)據(jù)的一般框架包括首先將去噪和歸一化的信號映射到單個細胞或ROI，然后將映射的數(shù)據(jù)與組織形態(tài),、空間位置和其他基因或蛋白質(zhì)表達數(shù)據(jù)相結(jié)合,。為了從去噪和歸一化的成像數(shù)據(jù)中獲得細胞或ROI測量值，有大量的分割工具可供選擇（例如DeepCell,、unet4nuclei,、ilastik、smfishhmrf,、NucleAlzer,、Stardist和Cellpose）,。對于下游的整合分析，最近的軟件工具包有Squidpy,、stLearn,、SpatialExperiment、Giotto,、Seurat和STUtility,。starfish等平臺軟件的持續(xù)開發(fā)，可以使用共享框架處理多種基于ISH的數(shù)據(jù),，對于數(shù)據(jù)分析和大規(guī)模集成來說將是引人注目的,。

在腫瘤異質(zhì)性研究的背景下，空間和scRNA-seq數(shù)據(jù)的整合是一種高分辨率的方法,，可以繪制組織中不同細胞類型的圖譜,。由scRNA-seq定義的參考細胞可以通過不同的技術(shù)來推斷空間數(shù)據(jù)中的細胞類型組成,，如Seurat中的標簽轉(zhuǎn)移,、scPred中的分類參考映射或SPOTlight、cell2location和RCTD中的矩陣分解,?？臻g和scRNA-seq數(shù)據(jù)的整合也可以通過歸因分析提高空間數(shù)據(jù)的準確性（例如Seurat、LIGER和gimVI）,。這些方法使用在降維潛在空間中識別的相似（相鄰）細胞信息來調(diào)整基因表達值,。當考慮到空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)中測量的物理距離時，可以更準確地估計這種潛在空間,。

使用空間位置信息的新方法,，如SPOTlight、cell2location和RCTD展示了改進的細胞類型的空間映射,，從單細胞參考到空間數(shù)據(jù)集,。TrendSceek和SPARK等方法檢測了跨組織區(qū)域的基因表達變化。其他方法,，如SpatialCPie和BayesSpace識別和可視化空間上接近的細胞群,。此外，Tangram,、SpaGCN和stLearn等方法使用從組織成像數(shù)據(jù)中提取的形態(tài)學特征,。結(jié)合測序和成像數(shù)據(jù)，這些方法可以將分子圖譜與細胞表型聯(lián)系起來,。

一個新興的分析類型：空間軌跡分析,，類似于單細胞軌跡分析（例如Slingshot、monocle3 和scVelo）,，用于識別組織內(nèi)的生物過程梯度（例如使用SPATA和STLERN）,?；趩渭毎能壽E方法可以應用于空間數(shù)據(jù)。例如,，RNA速度被應用于MERFISH數(shù)據(jù),。最近的空間軌跡分析方法可以重建一個組織內(nèi)發(fā)生的時空模式，例如癌癥的轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移,。這些新的分析方法將整個組織的空間維度與從轉(zhuǎn)錄組圖譜推斷的細胞狀態(tài)的時間變化相結(jié)合,。

多模態(tài)空間數(shù)據(jù)的互補性非常強大，因為它允許對細胞類型圖和/或細胞過程進行正交驗證,。兩種常用的整合方法是圖像配準（映射測量不同模式的相鄰組織切片）和通用坐標框架（映射成像配準不完全一致的切片）,。整合后，可以比較和/或組合來自重疊組織區(qū)域的蛋白質(zhì)和RNA信號,。通過圖像配準,，來自多個樣本的空間數(shù)據(jù)可以組合用于多元分析（例如在STutility、CODA,、HEMnet和STRISH中）,，或者與其他組織水平信息（如組織病理學注釋）進行比較。

此外,，空間鄰域信息可以與整個轉(zhuǎn)錄組的基因表達模式相結(jié)合,，以揭示細胞-細胞之間的相互作用。IMC和IHC數(shù)據(jù)的一種常用方法是使用統(tǒng)計測試來檢測組織中細胞類型之間的共定位（鄰域）,，如histoCAT,、smfishhmrf、CytoMAP和Squidpy中所應用的,。然而,，基于鄰域的方法尚未應用于配體-受體分析，這改善了單細胞相互作用分析的結(jié)果（例如NicheNet）,。在stLearn和Giotto中實現(xiàn)的方法使用配體-受體對來分析空間細胞-細胞相互作用,。用scRNA-seq數(shù)據(jù)驗證細胞-細胞相互作用（如通過配體-受體對的表達），可以使用來自成像數(shù)據(jù)的分子和/或細胞共定位分析（例如在ISH數(shù)據(jù)中使用STRISH和 histoCAT）,。

空間組學數(shù)據(jù)與腫瘤組織的H&E組織病理學圖像的整合為癌癥診斷和預后的臨床應用開辟了新途徑,。應用計算機視覺算法，然后與空間轉(zhuǎn)錄組學進行統(tǒng)計整合的創(chuàng)新方法能夠僅使用H&E圖像（例如st-net,、XFuse,、Tangram和HE2RNA）預測癌癥基因標記。也可以將蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)（例如IHC數(shù)據(jù)）和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)傳輸?shù)紿&E圖像,，然后訓練模型以高分辨率分類癌癥和其他細胞類型（例如使用HEMnet和XFuse）,。

增加了新的維度：希望和挑戰(zhàn)

大多數(shù)高水平的復用空間技術(shù)僅限于二維；然而,，共聚焦和雙光子顯微鏡提供高分辨率的三維信息,，并允許通過活體或活體成像監(jiān)測動態(tài)細胞變化,。因此，基于熒光的技術(shù),，如Confetti和LeGO可以提供與癌癥克隆性有關(guān)的另一層信息,。然而，這些方法不能提供亞細胞分辨率或達到類似于允許分子目標成像技術(shù)的分子特異性程度,。

三維成像和分子數(shù)據(jù)的同步采集已應用于厚組織切片或連續(xù)組織切片,。然而，在空間和時間分辨率,、分子或細胞通量以及數(shù)據(jù)采集時間之間通常存在權(quán)衡,。

空間技術(shù)的最新創(chuàng)新表明，我們正朝著在固定組織中以高空間分辨率捕獲3D多路復用轉(zhuǎn)錄組圖譜的方向前進,。例如STARmap可以在組織切片中檢測到多達1020個轉(zhuǎn)錄本,。然而，可檢測的靶點數(shù)量可能隨著組織厚度的增加而減少,。

雖然目前還沒有出現(xiàn),，但通過活體成像將數(shù)千個標記物的三維多模態(tài)分析與時間分辨率相結(jié)合是非常理想的。此外,，具有單細胞空間分辨率的細胞歷史記錄器（如MEMOIR,、intMEMOIR和Zombie）可通過基于成像的條形碼檢測實現(xiàn)譜系追蹤,。這些方法展示了多組學與譜系信息整合的潛力,，將這些技術(shù)與檢測代謝組學和表觀遺傳學數(shù)據(jù)的技術(shù)相結(jié)合，癌癥生物學將有一個更完整的多維圖像,。

最后,，在臨床上使用這些技術(shù)是未來幾十年轉(zhuǎn)化研究最令人興奮的挑戰(zhàn)之一。在FFPE切片上對蛋白質(zhì)進行多重分析的實質(zhì)性進展使患者更接近下一代病理學,，輔助診斷檢測將指導個性化藥物的治療/干預,。然而，將新生的轉(zhuǎn)錄組技術(shù)從細胞系過渡到組織會帶來許多挑戰(zhàn),，包括（1）固定和組織降解,，（2）染色和探針雜交，以及（3）三維數(shù)據(jù)和數(shù)據(jù)采集所需時間,。由于臨床樣本通常儲存在固定液中,，樣本之間的活檢和固定時間可能不同，因此RNA的完整性也會不同,。因此,，在將空間組學方法應用于臨床之前，需要提高其樣本質(zhì)量和穩(wěn)定性,。

此外,，為了獲得高質(zhì)量的軸向分辨率,，通常需要在組織樣品中進行樣品制備，如冷凍切片或清除,。這些方法并不總是與集成的組學解決方案兼容,，通常需要進一步優(yōu)化。還應考慮組織類型之間的形態(tài)差異,。例如,，肺組織布滿肺泡氣囊，冷凍切片時必須小心處理,。類似地,，在皮膚細胞和黑色素瘤樣本中，色素沉著會因其光吸收特性而對圖像采集產(chǎn)生負面影響,。對于空間蛋白質(zhì)組學和轉(zhuǎn)錄組學分析,，分析的便利性和成本的降低將是這些方法在轉(zhuǎn)化研究和精準醫(yī)療中廣泛使用需要克服的關(guān)鍵障礙。

盡管準備工作存在挑戰(zhàn),，但組織最終提供了豐富的信息,，對全面了解癌癥生物學至關(guān)重要。與大腦的不同解剖結(jié)構(gòu)相似,，腫瘤是由大量具有不同細胞類型和基因構(gòu)成的細胞群聚集而成,。腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性和惡性細胞與環(huán)境的錯綜復雜的相互作用使得單細胞分辨率和組織背景成為全面了解疾病進展的重要前提。

綜上所述,，研究團隊認為高度復用的FISH和基于測序的空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在多組學方面具有最大的潛力,，需要將細胞和分子通量與空間分辨率及易用性相結(jié)合。蛋白質(zhì)信息通常為基因表達數(shù)據(jù)提供附加值,，后者并不總是與蛋白質(zhì)的功能水平相關(guān),。然而，目前的蛋白質(zhì)組學技術(shù)需要進一步發(fā)展,，以克服多路復用的限制和通量,，提高其在癌癥異質(zhì)性研究中的分析能力。因此,，考慮到專門技術(shù)之間固有的權(quán)衡,，生物學問題應最終指導方法的選擇。

目前,，空間領(lǐng)域的大多數(shù)里程碑式的研究展示了理論潛力,，越來越多的研究產(chǎn)生了對癌癥的關(guān)鍵生物學見解。更廣泛地利用空間技術(shù)和分析技術(shù)的進步無疑將帶來新的診斷和癌癥治療方法,。

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參考文獻

Lewis, S.M., Asselin-Labat, ML., Nguyen, Q. et al. Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology. Nat Methods (2021).

圖片均來源于Nat Methods官網(wǎng)和參考文獻,，如有侵權(quán)請聯(lián)系刪除,。