什么是樹突狀細(xì)胞,？

樹突狀細(xì)胞（DC）在天然識別病原體和隨后的適應(yīng)性免疫反應(yīng)的活化中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,。DC通過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）分子呈遞抗原肽來誘導(dǎo)T細(xì)胞活化和分化，從而啟動適應(yīng)性反應(yīng),。DC還可分泌細(xì)胞因子和生長因子,，增強(qiáng)并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。除了活化Naive T細(xì)胞的作用外,，DC被認(rèn)為在引導(dǎo)效應(yīng)性T細(xì)胞的分化以及T細(xì)胞耐受性的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,。作為關(guān)鍵的哨兵細(xì)胞,，樹突狀細(xì)胞遍布全身，特別是淋巴器官以及環(huán)境接觸面,，如腸道和皮膚,。

樹突狀細(xì)胞活化——連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁

DC不斷感應(yīng)環(huán)境，在沒有炎癥信號的情況下,，被認(rèn)為能增強(qiáng)外周T細(xì)胞的耐受性[1,，2]。如果模式識別受體識別出病原體相關(guān)分子模式（PAMP）或損傷相關(guān)分子模式（DAMP）,，則會活化DC或發(fā)育成熟,。DC可表達(dá)一系列廣泛的PRR，包括表面和細(xì)胞核內(nèi)體Toll樣受體（TLR）,、C型凝集素和胞質(zhì)傳感器[3],。PRR活化后，DC經(jīng)歷代謝,、細(xì)胞和基因轉(zhuǎn)錄改變,，最終成熟為T淋巴細(xì)胞的有效活化劑。它們上調(diào)抗原呈遞的機(jī)制,，包括MHC II類,、共刺激分子和促炎細(xì)胞因子，然后遷移到次級淋巴組織的T細(xì)胞區(qū),，其可在此處刺激抗原特異性T細(xì)胞,。

樹突狀細(xì)胞發(fā)育

DC的發(fā)育受始于骨髓的多步驟分化級聯(lián)調(diào)控,。雖然準(zhǔn)確的樹突狀細(xì)胞上游前體爭論已持續(xù)多年,，但人們普遍認(rèn)為樹突狀細(xì)胞是以fms樣酪氨酸激酶3配體（Flt3L）依賴的方式并通過髓系祖細(xì)胞從造血干細(xì)胞中分化而來[4]。大多數(shù)樹突狀細(xì)胞來源于經(jīng)典/常規(guī)DC（cDC）以及漿細(xì)胞樣DC（pDC）的共同DC前體（CDP）,。pDC將在骨髓中繼續(xù)發(fā)育,，而CDc則在外周分化[5]。在病原體引發(fā)的炎癥過程中,，單核細(xì)胞可以分化成額外具有DC樣特性的單核細(xì)胞衍生細(xì)胞（MC）[6],。

經(jīng)典樹突狀細(xì)胞（cDC）

2014年，提出了一個傳統(tǒng)或經(jīng)典（cDC）亞群的統(tǒng)一分類系統(tǒng),，以消除越來越多的組織和物種特定亞群名稱所引起的歧義[6],。根據(jù)這一慣例，將兩個主要亞群描述為經(jīng)典1型DC（cDC1）和經(jīng)典2型DC（cDC2）,。cDC2細(xì)胞具一般DC家族的一般功能,，并通過MH II類抗原呈遞以及共刺激活化Naive CD4⁺ T細(xì)胞。cDC1細(xì)胞專門用于交叉提呈,，或在MHC I類上提呈外源抗原,，以誘導(dǎo)Naive CD8⁺ T細(xì)胞分化為細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）[7]。與其特異性一致,，cDC1和cDC2細(xì)胞也可表達(dá)活化CD4⁺ 或CD8⁺ 效應(yīng)T細(xì)胞功能所需的細(xì)胞因子,。cDC2驅(qū)動的輔助性T細(xì)胞極化會導(dǎo)致對細(xì)胞外病原體（包括微生物和蠕蟲感染）的強(qiáng)烈適應(yīng)性免疫反應(yīng)。CD8⁺ T細(xì)胞的交叉啟動能力保證cDC1能夠指導(dǎo)CTL對細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤做出反應(yīng),。值得注意的是,，1868年，保羅·朗格罕（Paul Langerhans）根據(jù)其巨噬細(xì)胞樣胚胎起源的揭示,，把典型DC朗格漢斯細(xì)胞（LC）重新歸類為巨噬細(xì)胞,。[8],。

cDC可通過其分支狀“樹突狀”形態(tài)和cDC特征基因(包括CD11c和MHC II類(HLA-DR in human))的高表達(dá)來與其他單核吞噬細(xì)胞區(qū)別,。CD8或CD103所存在的組織決定了小鼠cDC1細(xì)胞的分類，除了常見的cDC標(biāo)志物外,，還可通過CD11b的表達(dá)來區(qū)分鼠cDC2細(xì)胞（表1）,。 可以通過人cDC1細(xì)胞各自表達(dá)的BDCA1和BDCA3以及其他標(biāo)志物來將其與cDC2區(qū)分開來。由于moDC和某些巨噬細(xì)胞難以與CDC區(qū)分開來,，因此區(qū)分典型的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)志物物（如Ly6C和F4/80）以及某些標(biāo)志物（如CD64,、MAR-1、MerTK和CD88）的差異表達(dá),，將有助于將CDC與其他細(xì)胞類型區(qū)分開來[9],。

cDC1細(xì)胞的發(fā)育需要BATF3 [10]。選擇性敲除實(shí)驗(yàn)已證明cDC1在病毒免疫和細(xì)胞內(nèi)感染防御中的重要作用[7],。DC的癌癥療法的目標(biāo)是生成cDC1,，因?yàn)樗鼈冊隍?qū)動CTL介導(dǎo)的抗腫瘤反應(yīng)方面具有潛力[11],。幾種轉(zhuǎn)錄因子（包括RelB、RBP-J,、IRF4和IRF2）對cDC2的發(fā)育至關(guān)重要[12],。

漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞（pDC）

漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞是樹突狀細(xì)胞的一個獨(dú)特亞群，其具有分泌I型IFN的特殊功能[13,，14],。它們可表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)錄因子IRF7和內(nèi)體TLR，這使得它們能夠快速分泌大量IFNα和β來應(yīng)對病毒感染[15],。從表型上區(qū)分,，可以通過pDC分泌時的形態(tài)（與漿細(xì)胞類似）、CD11c和MHC II類等cDC特征基因的非典型表達(dá)以及特異性pDC標(biāo)志物的檢測來區(qū)別pDC與CDc（表1）,。雖然在鼠pDC上檢測到了中等表達(dá)水平的CD11c,，但在人樹突狀細(xì)胞上沒有發(fā)現(xiàn)CD11c[16]。相反,，通過人CD123和CD303的表達(dá)以及小鼠Bt2和B220的表達(dá),，可將pDC與cDC區(qū)分開來[16，17],。

pDC的發(fā)育依賴于E蛋白轉(zhuǎn)錄因子E2-2的調(diào)節(jié)[18],。與cDC一樣，已證明pDC及其前體對Flt3配體信號具有依賴性,。除了它們獨(dú)特的表型,，pDC還可表達(dá)淋巴譜系的一些特征，因?yàn)槠鋵D(zhuǎn)錄因子E2-2具有依賴性[19],。E2-2屬于E蛋白家族的調(diào)節(jié)劑,，已知對淋巴系譜系定性型不可或缺。最近,，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析再次表明,，部分pDC是由淋巴樣前體發(fā)育而來的[20]。 無論其來源如何,，pDC明顯具有髓樣細(xì)胞和淋巴樣細(xì)胞的共同特性,，這是最初定義這種細(xì)胞類型的決定性特征。

選擇性敲除研究已證明pDC在控制病毒感染中的重要性,。例如,，需要pDC來控制小鼠肝炎病毒（MHV）和小鼠冠狀病毒的感染[19]。與之相反，pDC在大量產(chǎn)生IFN的疾病中發(fā)揮致病作用,，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）等自身免疫性疾病[19],。母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞腫瘤（BpDCN）來源于pDC，是一種罕見的侵襲性白血病[21],。

表 1.與樹突狀細(xì)胞亞群相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,、表面標(biāo)志物和功能。

樹突狀細(xì)胞異質(zhì)性

單細(xì)胞分析與傳統(tǒng)方法的結(jié)合揭示了定義的每群經(jīng)典DC亞群都有相當(dāng)大的異質(zhì)性,。例如,，非經(jīng)典AXL⁺人DC被證明同時具有cDC和pDC特性，與之對應(yīng)的老鼠也有類似的表達(dá)譜[22,，23,，24，25]。這些DC可提呈抗原,，但無法生成I型IFN,，因此被認(rèn)為是一種“過渡性”DC亞群。也可以用免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)而非發(fā)育譜系來區(qū)分DC異質(zhì)性,。例如,，肺癌組織中存在功能減弱的人和小鼠樹突狀細(xì)胞[26]，被定義為“富含免疫調(diào)節(jié)分子的成熟樹突狀細(xì)胞”（mregDC）,。

癌癥研究中的樹突狀細(xì)胞

DC是癌癥免疫反應(yīng)的關(guān)鍵決定因素,。循環(huán)DC的相對水平是癌癥進(jìn)展的標(biāo)志，因?yàn)樵谕砥诤谏亓龊腿橄侔┗颊咧杏^察到其水平降低[11],。DC可通過識別和浸潤腫瘤,，分泌調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境的可溶性因子，并呈遞腫瘤相關(guān)抗原,，促發(fā)T細(xì)胞反應(yīng),，從而促進(jìn)癌癥免疫功能[27]。特別地,，DCs,，尤其是cDC1交叉呈遞抗原并促進(jìn)CTL活性的能力有助于檢測下調(diào)MHC I類的腫瘤。實(shí)際上在多種癌癥中,，cDC1的擴(kuò)增與治療反應(yīng)和提高患者生存率息息相關(guān)[28],。相反，腫瘤微環(huán)境中功能失調(diào)或耐受性DC則觸發(fā)免疫抑制,，從而促進(jìn)腫瘤生長[27],。

研究樹突狀細(xì)胞的工具

培養(yǎng)方法

[29]已經(jīng)描述了從各種來源擴(kuò)增DC的培養(yǎng)方法，包括骨髓,、循環(huán)單核細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）,。體外培養(yǎng)系統(tǒng)的主要限制在于其傾向于生成單核細(xì)胞來源的細(xì)胞，而不是cDC和pDC,。從小鼠骨髓中獲得DC的兩種主要方法被廣泛使用,。1）可以在培養(yǎng)物添加GM-CSF，但生成的細(xì)胞異質(zhì)高,，包括粒細(xì)胞,、MC和cDC樣細(xì)胞[30]。2）添加Flt3L的培養(yǎng)物可用于生成cDC樣和pDC樣細(xì)胞,，并且由于其能夠生成相對純且具有功能的DC群體而經(jīng)常被優(yōu)先使用,。在缺乏替代性人造血來源的情況下，從人PBMC通過添加GM-CSF培養(yǎng)仍然是生成moDC的主要方法,。盡管人或小鼠cDC細(xì)胞系很少被廣泛使用,，但部分具有pDC特征的人細(xì)胞系已被用于研究人pDC的特征,。然而，應(yīng)謹(jǐn)慎解讀人和小鼠體外培養(yǎng)的樹突狀細(xì)胞結(jié)果,，因?yàn)檫@些結(jié)果只是近似于體內(nèi)生物學(xué),。

功能分析

活化：多種分子可活化或使成熟樹突狀細(xì)胞，包括LPS,、含CpG的核酸和其他病原體或損傷相關(guān)的刺激物和模擬物,。可以通過MHC I類和II類以及共刺激分子的表達(dá)和細(xì)胞因子分泌來評價細(xì)胞成熟,。

流式細(xì)胞術(shù)

DC和其他細(xì)胞類型可表達(dá)Fc受體,，而后者能夠以非特異性方式與抗體結(jié)合。Fc受體阻斷劑應(yīng)與流式抗體分析結(jié)合使用,，以避免非特異性結(jié)合,。

OMIP-044和OMIP-061用于人和小鼠DC設(shè)門策略：OMIP（優(yōu)化多色免疫熒光panel）是指一套經(jīng)過全面測試和驗(yàn)證的抗體和試劑方案，可一起用于檢測特定細(xì)胞狀態(tài)或反應(yīng),。OMIP信息均發(fā)表在Cytometry Part A（Wiley Online Library）,，這些OMIPs是為流式細(xì)胞術(shù)設(shè)計的，但OMIPs可能被定義為圖像細(xì)胞術(shù),、熒光顯微鏡和其他基于多色熒光的方法,。

表 2.Cytometry Part AOMIP用于樹突狀細(xì)胞分型

免疫檢測

細(xì)胞因子Flt3L,、SCF（干細(xì)胞因子）和GM-CSF（粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）對血液中發(fā)DC亞群（常規(guī)細(xì)胞和漿細(xì)胞樣）的發(fā)育中起著決定性作用。這些細(xì)胞因子由各種組織基質(zhì)生成,，包括成纖維細(xì)胞,、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞,、肥大細(xì)胞,、NK細(xì)胞以及活化的T細(xì)胞。也可在體外通過用IL-4和GM-CSF刺激單核細(xì)胞獲得DC,。當(dāng)暴露刺激（如TLR配體或微生物）時,，靜止DC經(jīng)歷了多種功能和表型改變（為成熟過程的一部分），這些改變可以以自分泌或旁分泌的方式進(jìn)一步受到細(xì)胞因子（如IL-1,、IL-4,、TNF,、1型干擾素和TSLP）的影響,。

表3：樹突狀細(xì)胞分化、活化和分泌的關(guān)鍵細(xì)胞因子,。

成熟DC作為主要抗原提呈細(xì)胞根據(jù)刺激分泌不同的細(xì)胞因子,，并通過Th1或Th2途徑使Naive T細(xì)胞分化，從而造成炎癥或免疫抑制的環(huán)境,。例如,，DC分泌的IL-12可以誘導(dǎo)Th1分化，然后通過IL-6和IL-1β等細(xì)胞因子促進(jìn)免疫炎癥環(huán)境,。DC還可分泌許多趨化因子,，如CCL2、CCL3,、CCL4,、CCL5、CXCL9和CXCL10,，它們能在不同的時期招募多種類型的免疫細(xì)胞促進(jìn)免疫反應(yīng)（未成熟DC,、單核細(xì)胞、T細(xì)胞）,。 Invitrogen 65-plex Human Immune monitoring panel多因子試劑盒可提供更全面的分析成熟DC細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子,。

多因子免疫試劑盒