細(xì)菌是原核微生物的一類,，是一類形狀細(xì)短,，結(jié)構(gòu)簡單，多以二分裂方式進(jìn)行繁殖,。水產(chǎn)動物的細(xì)菌病種類多,、分布廣，可引起養(yǎng)殖水產(chǎn)動物大批死亡,，有的細(xì)菌病給養(yǎng)殖生產(chǎn)造成極大的損失,。在藥店（或池塘）對發(fā)病水產(chǎn)動物進(jìn)行準(zhǔn)確的細(xì)菌分離是診斷和治療細(xì)菌病的基礎(chǔ)。本文就水產(chǎn)動物細(xì)菌分離方法及其注意事項作以下說明,，以期為水產(chǎn)動物細(xì)菌病進(jìn)行準(zhǔn)確的診斷和治療提供幫助,。

一、培養(yǎng)基的選擇

在對水產(chǎn)動物細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng)前,，應(yīng)考慮所分離的細(xì)菌的特性,，對營養(yǎng)要求高還是不高，選擇適合其生長需要的培養(yǎng)基,。如氣單胞菌對營養(yǎng)要求不高,，普通的培養(yǎng)基即可生長；鏈球菌對營養(yǎng)要求較高,，在普通培養(yǎng)基上不長,，需要營養(yǎng)較高的培養(yǎng)基。

目前,，公司（利洋）提供的培養(yǎng)基主要是硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）,、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）和腦心浸液瓊脂（BHIA）（見圖1）。TCBS主要用于致病性弧菌的選擇性分離,，TSA主要用于常見細(xì)菌的分離,，如氣單胞菌、諾卡氏菌,、愛德華氏菌等,，BHIA主要用于對營養(yǎng)要求較高的細(xì)菌的分離,，如鏈球菌。

圖1 公司（利洋）提供的培養(yǎng)皿的種類

二,、細(xì)菌的分離

在對水產(chǎn)動物細(xì)菌病進(jìn)行檢查時,，須對水產(chǎn)動物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，常用的分離培養(yǎng)方法是瓊脂培養(yǎng)皿接種分離法,。將細(xì)菌接種瓊脂培養(yǎng)皿,，使其在培養(yǎng)皿表面分散開，使個別細(xì)菌能固定在某一點,，經(jīng)培養(yǎng)生長繁殖后形成單個菌落,。常用的細(xì)菌分離方法有平板劃線分離法和涂布培養(yǎng)法。

（一）平板劃線分離法

左手拿瓊脂培養(yǎng)皿,，打開培養(yǎng)皿,，使之與水平面成45度角（見圖2左）；右手拿接種棒（帶接種環(huán)）,，將接種環(huán)于酒精燈火焰中灼燒滅菌,，待其冷卻后，蘸取檢測材料（水產(chǎn)動物的肝臟,、脾臟,、腎臟、腦等組織）少許,，劃線接種于瓊脂培養(yǎng)基上（見圖2右）,。劃線的方法有：蛇形劃線（見圖3左）、區(qū)域劃線（見圖3右）等,，選擇其中一種進(jìn)行劃線接種,。劃線完畢后，將接種環(huán)灼燒滅菌,，在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記客戶名稱,、樣品來源、分離部位及分離日期（見圖4）,。

圖2 細(xì)菌分離的操作方式

圖3 細(xì)菌分離的劃線方法

圖4 劃線接種完畢后培養(yǎng)皿的標(biāo)記方式

（二）涂布平板法

取一定量的組織液（如血液,、腹水等）滴加在培養(yǎng)基表面，在用無菌的玻璃涂布棒將其均勻分散至整個培養(yǎng)基表面,。

三,、細(xì)菌的培養(yǎng)

接種后的培養(yǎng)皿，在合適的溫度下恒溫培養(yǎng),，培養(yǎng)溫度一般為25～28℃（藥店進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)時室溫培養(yǎng)即可）,。特殊的細(xì)菌需要低溫（25℃以下）培養(yǎng)，如殺鮭氣單胞菌、諾卡氏菌等,。在培養(yǎng)箱中,，培養(yǎng)皿應(yīng)倒置培養(yǎng)，以便細(xì)菌能夠更好的吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì),，利于生長,。

通過對發(fā)病水產(chǎn)動物進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)，最終目的是要在培養(yǎng)基上形成單個菌落（見圖5,、圖6），以便進(jìn)行形態(tài)觀察及后續(xù)的純化,、鑒定,、保存和藥敏試驗等操作。

圖5 采用平板劃線分離法分離的細(xì)菌

圖6 采用涂布平板法從腹水中分離的細(xì)菌

四,、注意事項

1,、根據(jù)所分離的細(xì)菌的特性，選擇合適的培養(yǎng)基,。

2,、細(xì)菌分離培養(yǎng)的整個過程要嚴(yán)格無菌操作，培養(yǎng)基和用具須徹底滅菌,；操作時必須靠近酒精燈火焰,，在火焰附近操作；操作完畢后,，禁止再讓培養(yǎng)基接觸外界空氣,。

3、接種環(huán)在灼燒滅菌后,，不能立即勾取細(xì)菌材料,，應(yīng)在酒精燈旁冷卻，防止接種環(huán)過熱殺死分離培養(yǎng)的細(xì)菌,；同時也要防止已經(jīng)勾取細(xì)菌材料的接種環(huán),，不慎通過火焰而將細(xì)菌殺死。

4,、劃線接種時不要劃破瓊脂,，不要劃得太疏，以免造成浪費,，不要重復(fù)劃線,，以免形成菌苔，劃線要直,、要長,、要密而不重疊，最終目的是在培養(yǎng)皿上長出單個菌落。

5,、培養(yǎng)時,，要在合適的溫度下培養(yǎng)，避免因溫度過高或過低導(dǎo)致分離不出細(xì)菌,。