紅花臘梅基因組為木蘭類進化和花被片顏色發(fā)展的分子機制提供見解

期刊：The Plant Journal

發(fā)表時間：2021.10

IF:6.417

2021年10月，中南林業(yè)科技大學聯(lián)合河南林科院在The Plant Journal發(fā)表了題為“The red flower wintersweet genome provides insights into the evolution of magnoliids and the molecular mechanism for tepal color development”的研究論文,。本文對一種新的臘梅品種——紅花臘梅的全基因組進行了高質(zhì)量的測序和組裝,，并通過整合基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)為木蘭類植物的進化和花色發(fā)育的分子機制提供了新的認識,。邁維代謝提供了代謝組的檢測分析服務(wù),。

臘梅(Chimonanthus praecox)起源于中國，已有1000多年的栽培歷史,，由于具有較高的經(jīng)濟價值和觀賞價值被廣泛栽培,。梅花的整體顏色主要由中部花被片決定，通常為黃色或淡黃色,。根據(jù)內(nèi)花被片的顏色,，臘梅品種可分為三大類: Concolor類, Intermedius類,和Patens 類。本研究前期的梅花種質(zhì)資源調(diào)查中發(fā)現(xiàn)了一個新的梅花資源類型新的梅花資源類型Rubrum Group—花期早期和盛花期花被的內(nèi),、中花被片基本上都是紅色的,。為了與已有的三種類型區(qū)分開來，將新梅花分類為紅梅屬,，該新類型的發(fā)現(xiàn)為探索梅花花色形成機制提供了資源,，也為今后利用分子標記輔助育種精確控制梅花花色提供了依據(jù)。

本研究對新發(fā)布的C. praecox 品種'Hongyun’進行了全基因組測序,，基于PacBio Sequel II測序平臺和Hi-C輔助組裝獲得了高質(zhì)量的染色體水平基因組;并通過與其他6種木蘭類,、單子葉和雙子葉以及其他代表性被子植物的基因組比較分析，重新定義木蘭類的進化位置,；最后基于基因組,、轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)探討了梅花的著色分子機制。

春季采集7年生紅梅C. praecox 'Hongyun’的新葉進行全基因組測序,。

采集C. praecox的葉,、根、莖,、果實和7個發(fā)育階段的花被片進行RNA測序,。

來自三個臘梅資源類型（CW，Concolor wintersweet,；PW,，Patens wintersweet和RW, Rubrum wintersweet）不同顏色的花被片被用于轉(zhuǎn)錄組和代謝組分析（n=3）,。

采用Illumina Novaseq 6000和PacBio SMRT對梅花的基因組進行測序,，獲得V1.0組裝體，接著利用Hi-C平臺錨定到11條染色體,，總長度為737.03 Mb(圖1),，BUSCO分析顯示該基因組的完整性為95%。根據(jù)同源性和從頭預測以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),，鑒定并預測了25 832個蛋白質(zhì)編碼基因模型,，平均編碼序列(CDS)長度為1256 bp，平均基因長度為9965 bp,。其中 95.83%的預測蛋白編碼基因可以通過公共數(shù)據(jù)庫的功能注釋進行定位(圖1b),。

圖1. Hi-C輔助組裝的紅梅C. praecox 'Hongyun’ V1.0染色體。(a)分辨率為200kb的Hi-C互作熱圖,；(b) C. praecox的基因組組裝與注釋圈圖,。

臘梅的基因組為探索木蘭類植物的進化狀態(tài)提供了更多的數(shù)據(jù)。如圖2的三棵樹表明木蘭類植物是雙子葉植物的姐妹群,，在它們的共同祖先從單子葉植物分化出來后,，它們的自舉支持度大于60%。隨后對123個類群的1082個基因進行聚類分析得出的拓撲結(jié)構(gòu)分析的結(jié)果也強烈支持木蘭類植物是雙子葉植物的姐妹,，自舉支持度大于70%,。前人對木蘭類植物進化位置的研究結(jié)果不一致，可能是由于不同的造樹方法,、ILS的存在,、分類單元取樣的限制以及木蘭類化合物在進化早期分化迅速等原因。本研究充分考慮了可能導致木蘭類植物進化定位錯誤的各種因素,，通過多種方法的結(jié)果數(shù)據(jù)表明木蘭類植物很可能是雙子葉植物的姐妹,。

圖2.利用來自25個物種的70個單拷貝基因家族的核苷酸和氨基酸序列構(gòu)建C. praecox與其他植物的系統(tǒng)發(fā)育樹。(a)基于部分核苷酸序列串聯(lián)序列比對的系統(tǒng)發(fā)育樹,；(b)基于部分核苷酸序列(左)和氨基酸序列(右)串聯(lián)序列比對的系統(tǒng)發(fā)育樹,。

花被片顏色是臘梅的主要特征。例如,，Concolor梅花的中部和內(nèi)部花被片都是黃色的; Patens梅花的中部花被片為黃色,，內(nèi)花被片為紅色; Rubrum梅花的中花被片和內(nèi)花被片均為紅色。為了了解梅花花被顏色差異,，利用UPLC -MS/MS檢測了這三種花（CW：Concolor wintersweet,、PW：Patens wintersweet和RW：Rubrum wintersweet）在開花早期花被片的中間和內(nèi)側(cè)的黃酮類代謝產(chǎn)物(圖5a)，檢測到7種不同的花青素,。與其他花青素代謝產(chǎn)物相比,，紅花被片中三種花青素苷(花青素-3- o -半乳糖苷,、花青素-3- o -葡萄糖苷和花青素-3- o -蘆丁苷)的含量顯著高于黃花被片(圖5b)，表明花青素苷導致了梅花的顏色差異,。

為了進一步了解臘梅紅色花被片形成的分子機制,，利用與代謝組學分析相同的組織樣本進行了轉(zhuǎn)錄組測序。根據(jù)全基因組的功能注釋進一步注釋了涉及類黃酮(ko00941)和花青素(ko00942)生物合成的所有基因,。其中,，CpANS1 (Cpr011668)在紅色花被片中高度表達，而在黃色花被片中表達幾乎可以忽略(圖5c),。因此結(jié)合代謝組學和轉(zhuǎn)錄組學分析認為CpANS1是梅花紅色形成的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因,。

圖5. C. praecox色素合成關(guān)鍵候選基因的鑒定。(a) 三種梅花(RW,、PW和CW)早期的花被片表型,；(b) RW、PW和CW花被片內(nèi)(I)和中(M)部花青素的相對含量,；(c)花青素生物合成途徑相關(guān)結(jié)構(gòu)基因表達譜（FPKM）,。

為了探究CpANS1在梅花紅花被片中高表達的原因，從三個不同品種中分離和克隆了CpANS1的CDSs和相應(yīng)的啟動子片段,。測序結(jié)果顯示,，三個品種CpANS1基因的核心啟動子區(qū)和翻譯氨基酸序列沒有差異，表明CpANS1啟動子序列或翻譯氨基酸序列的差異并不是這三個品種花色差異的原因,。

在基因組水平上鑒定了99個R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子,，通過最大似然樹(ML) 以擬南芥的125個MYBs為模板將這些MYB轉(zhuǎn)錄因子分為25個不同的亞組，通過系統(tǒng)進化樹分析鑒定出S6亞群的兩個MYBs (Cpr017300和Cpr001125)(圖6a),。進一步結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析和7個發(fā)育階段花被片樣品(圖6b)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的WGCNA分析,，3個MYBs被鑒定并顯示與CpANS1共表達，其中Cpr017300(注釋為CpMYB1)可能編碼一個調(diào)控CpANS1表達的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子,。紅,、黃花被片不同比較組的相關(guān)性分析進一步證實CpANS1表達與花青素苷呈正相關(guān)且CpMYB1可能與CpANS1呈正相關(guān)。

圖6. C. praecox花青素相關(guān)R2R3-MYB候選物鑒定,。(a) C. praecox (99個成員)和擬南芥(125個成員)R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育樹,；(b)紅梅C. praecox 'Hongyun’的七個發(fā)育階段表型。

MYB作為花青素代謝途徑的調(diào)控基因,，其CDS或啟動子的突變會影響其自身的活性,，從而影響下游基因的表達。從三個不同品種（RW,、PW和CW）克隆CpMYB1的CDSs發(fā)現(xiàn),，與RW和PW相比，在CWI和CWM轉(zhuǎn)錄本中都存在四個堿基(AAAG)的缺失,。對于CpMYB1的CDSs,，'AAAG’后的'GGA’重復次數(shù)在不同的紅色花被組織中存在差異,。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的序列也通過PCR擴增得到驗證。CW品種CpMYB1的CDS中'AAAG’的缺失會導致移碼突變,，可能導致其調(diào)節(jié)功能的喪失,，并最終導致 CW品種中的花青素代謝途徑終止，即使它在內(nèi)部花被片中高表達,。相比之下,，在PW和RW中，CpMYB1在紅色花被片中的表達水平高于黃色花被片,，表明CpMYB1的表達水平與花被片的顏色直接相關(guān)。因此認為CpMYB1可能調(diào)控了梅花不同類群的花色差異:CpMYB1的缺失導致梅花在CW品種中失去紅色,，而CpMYB1的表達水平?jīng)Q定了梅花在PW和RW中的花被色,。此外，通過克隆啟動子序列還發(fā)現(xiàn)三個品種CpMYB1核心啟動子的序列沒有差異,，表明可能是其他調(diào)控因子而不是啟動子引起CpMYB1的特異性表達,。

在大多數(shù)物種中，花青素的生物合成受MYB,、bHLH和WD40 (MBW)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因啟動子的結(jié)合調(diào)控,。通過同源性搜索獲得了C. praecox基因組中bHLH和WD40的同源物分別為CpbHLH1 (Cpr015629)、CpbHLH2 (Cpr020215),、CpWDR1 (Cpr013636), 和CpWDR2 (Cpr014700) ,。酵母雙雜交實驗表明，CpMYB1可以與CpbHLH1和CpbHLH2互作,，但不能與CpWDR1和CpWDR2互作,。進一步的結(jié)果表明CpbHLH1和CpWDR2之間也存在交互作用(圖7b)。因此,，CpbHLH1,、CpWDR2和CpMYB1之間可以形成MBW絡(luò)合物。

為了驗證CpMYB1及其MBW復合物對CpANS1的激活活性,，在矮牽牛W59 x axi花瓣上進行了過表達實驗,。GUS染色結(jié)果表明,CpMYB1驅(qū)動的MBW復合物對CpANS1啟動子有強烈激活活性, 而Cpmyb1^E201（201位氨基酸同義突變，在CDS的603位點缺失AAAG堿基導致移碼突變) 則失去了激活 CpANS1 啟動子的能力（圖 7c）,。同時還進行了煙草的過表達實驗來驗證CpMYB1的功能,，結(jié)果表明CpMYB1和Cpmyb1E201都不能加深煙草葉片和愈傷組織的顏色；以上說明CpMYB1可能需要與C. praecox的bHLH和WD40形成一個復合物(MBW)來發(fā)揮其調(diào)控功能,。

圖7. CpMYB 1驅(qū)動的MBW復合體促進CpANS1的轉(zhuǎn)錄,。(b)酵母雙雜交分析CpMYB1和CpbHLH1、CpbHLH2,、CpWDR1和CpWDR2之間的互作;(c) GUS活性測定,。

本文對一種新的臘梅品種—紅花臘梅C. praecox 'Hongyun’的全基因組進行了高質(zhì)量的測序和組裝,，該基因組序列為基因組編輯和分子標記輔助育種提供了有價值的資源，并為深入了解木蘭類植物的進化提供了依據(jù),。通過整合基因組,、轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)闡明了梅花花色發(fā)育的分子機制：發(fā)現(xiàn)CpANS1和轉(zhuǎn)錄因子CpMYB1在花被顏色發(fā)育的調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而CpMYB1需要與bHLH和WD40形成復合物才能充分發(fā)揮其調(diào)控功能,。本研究不僅為木蘭類植物進化和花色發(fā)育的分子機制提供了新的認識,，而且為后續(xù)梅花的功能基因組學研究和分子育種奠定了基礎(chǔ)。