今天給同學(xué)們分享一篇關(guān)于非腫瘤+單細(xì)胞聯(lián)合bulk數(shù)據(jù)的生信文章 “ Expression of Immune Related Genes and Possible Regulatory Mechanisms in Alzheimer’s Disease ”,，這篇文章于今年發(fā)表在 Frontiers in Immunology 雜志上,，影響因子=7.561。本研究通過結(jié)合單細(xì)胞RNA（scRNA）和bulk-seq測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析,，研究了IRG在AD中的表達(dá)特征和可能的調(diào)控機(jī)制,。

1.AD中PBMC的scRNA分析

分析了來自GEO數(shù)據(jù)庫(kù)的scRNA測(cè)序數(shù)據(jù)集（GSE181279），其中包括36849個(gè)PBMC,，包括來自AD患者的22775個(gè)細(xì)胞和來自對(duì)照組（NC）的14074個(gè)細(xì)胞,。過濾后，保留了24679個(gè)細(xì)胞,，包括來自AD患者的14033個(gè)細(xì)胞和來自NC的10646個(gè)細(xì)胞,。每個(gè)樣本的表達(dá)特征如圖1A所示。nCount_RNA表示唯一分子標(biāo)識(shí)符（UMI）的數(shù)量,，與表示基因數(shù)量的nFeature_RNA正相關(guān),，相關(guān)系數(shù)為0.92（圖1B）。確定了前10個(gè)HVG（圖1C）,。S100A8和S100A9是前兩個(gè)HVG,，它們是在炎癥條件下高度表達(dá)的small calcium-binding proteins,。PCA識(shí)別了所有15個(gè)P值<0.05的PC，如圖1D所示（圖1D）,，使用10個(gè)PC識(shí)別了8個(gè)集群,，并列出了每個(gè)集群的前10個(gè)差異基因（圖1E）。

圖1 AD中PBMC的scRNA分析

根據(jù)之前的一項(xiàng)研究,，這些集群可以通過標(biāo)記基因分配給已知的細(xì)胞譜系,。使用t-SNE分析可視化了八個(gè)聚類（圖2A）。橢圓標(biāo)記的NK集群顯示AD組中NK集群的百分比降低（圖2B）,。細(xì)胞類型標(biāo)記基因的表達(dá)顯示在點(diǎn)陣圖（圖2C）和小提琴圖（圖2D）中,。每個(gè)集群中細(xì)胞的數(shù)量和比例分別如圖2E所示。與NC組相比,，AD組的NK集群顯著減少（5%對(duì)21%）,，而CD4 T細(xì)胞在AD組中顯示出增加的趨勢(shì)（圖2F）。在隨后的分析中,，作者主要關(guān)注PBMCs的NK集群,。

圖2 每個(gè)集群的標(biāo)記基因表達(dá)

2.AD中PBMC細(xì)胞集群的IRG評(píng)分

為了研究AD中PBMC的IRG表達(dá)特征，基于ImmPort數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)各集群的EG進(jìn)行篩選以生成IRG,，該數(shù)據(jù)庫(kù)總結(jié)了已發(fā)表研究的IRG,，并從PBMC中每個(gè)集群的差異基因中獲得了212個(gè)IRG。AUCell R包用于確定每個(gè)細(xì)胞系的IRG活性（圖3A）,。表達(dá)更多基因的細(xì)胞表現(xiàn)出更高的AUC值,，這些細(xì)胞主要在NK和DC細(xì)胞中，顏色為黃色（圖3B）,。由于AD組中NK聚類顯著減少（圖2B,，F(xiàn)），作者進(jìn)一步對(duì)來自PMC的NK聚類中的差異基因進(jìn)行了GO和KEGG分析,。這些功能與富集通路主要與抗原處理和免疫應(yīng)答有關(guān)（圖3C,，D）。

圖3 AD中PBMC細(xì)胞集群的IRG評(píng)分

3.來自bulk seq測(cè)序數(shù)據(jù)的AD差異基因

為了研究AD中腦組織的表達(dá)特征,，分析了包括310名AD患者和157名對(duì)照組的散裝RNA測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE33000,，以探索AD大腦中的差異基因，并篩選PBMC和腦組織之間的常見IRG,。調(diào)整后的 P 值< 0.05 的差異基因和 |logFC|>0.03,。此后，在AD大腦中保留了5339個(gè)上調(diào)和5542個(gè)下調(diào)差異基因（圖4A）,。圖中顯示了top100上調(diào)和top100下調(diào)差異基因的熱圖,，并且在組內(nèi)觀察到相對(duì)一致性（圖4B）。有趣的是,，與AD的PBMC中NK集群的表達(dá)特征類似,，AD大腦中差異基因的前10個(gè)GO功能通路也集中在免疫反應(yīng)上（圖4C,，D）。這些數(shù)據(jù)表明,，AD PBMC中NK集群的差異基因與AD大腦中的差異基因具有相似的GO通路，這表明NK細(xì)胞在AD患者大腦中的潛在作用,。

圖4 來自GSE33000數(shù)據(jù)集的AD差異基因

4.常見IRG和相關(guān)監(jiān)管轉(zhuǎn)錄因子

由于來自PBMC的NK集群中GO的差異基因和來自AD大腦的GO的差異基因主要集中在免疫反應(yīng)上,，作者進(jìn)一步研究了NK cells與AD腦之間IRGs的共同表達(dá)特征。在PBMC NK集群和AD大腦中共發(fā)現(xiàn)了70個(gè)常見的IRG（圖5A）,。GSE33000中前40個(gè)常見IRG的表達(dá)主要活躍于來自PBMCs的NK集群（圖5B）,。

為了研究IRG的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，從HumanTFDB（http://bioinfo.life.）獲得了1665個(gè)TF的列表,。保留了來自PBMC的AD NK集群中的34個(gè)TF和AD大腦中的765個(gè)TF,。此外,，此外,，17種常見的TFs在AD周邊NK集群和AD大腦中均表達(dá)（圖5C）。FindAllMarkers 函數(shù)是使用默認(rèn)參數(shù)應(yīng)用的,。在這種情況下,，僅選擇在超過25%的細(xì)胞中表達(dá)的陽性基因,，logFC截止值為0.25。在所有集群中共鑒定出1979個(gè)獨(dú)特的標(biāo)記基因,。對(duì)于NK集群,，共鑒定出778個(gè)標(biāo)記基因，僅34個(gè)基因?qū)儆赥F,。因此,，周邊NK標(biāo)記基因、AD腦差異基因和TF數(shù)據(jù)庫(kù)交集的TF僅為17個(gè),。顯示了GSE33000和AD周邊NK集群中17個(gè)TF的表達(dá)式（圖5D,，E）。13個(gè)TF在AD大腦中上調(diào),，所有17個(gè)TF在NK和NKT細(xì)胞中活躍,。PPI網(wǎng)絡(luò)表明，STAT3可能作為IRG轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的中樞基因發(fā)揮關(guān)鍵作用（圖5F）,。

圖5 常見的IRG和相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

5.確認(rèn)NK在AD大腦的浸潤(rùn)情況

確認(rèn)NK細(xì)胞浸潤(rùn)到大腦中,。作者從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中選擇了scRNA測(cè)序數(shù)據(jù)集GSE142853，該數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)來自3XTg-AD小鼠大腦的分選NK細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序,。共有3250個(gè)細(xì)胞,，包括來自AD小鼠的1634個(gè)細(xì)胞和來自NC小鼠的1616個(gè)細(xì)胞。生成了十個(gè)集群（圖6A）,。AD組的聚類6百分比高于NC組（4.6%對(duì)2.9%）（圖6B）,。cytotoxic molecule (Cstd), pro-inflammatory chemokines (Ccl3, Ccl4), adhesion molecules (Icam1)和NK cell activation molecules (Tbx21, Nfatc1, Nfkbia, and Klra9) 在集群6中高度表達(dá)（圖6C,，D）。此外,，使用SingleR和Celldex R包對(duì)這些聚類進(jìn)行注釋,，并使用分?jǐn)?shù)計(jì)算預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。SingleR是一種用于scRNA測(cè)序數(shù)據(jù)的自動(dòng)注釋方法,。SingleR提供具有已知細(xì)胞類型標(biāo)簽的樣本的參考表達(dá)數(shù)據(jù)集,，并且可以根據(jù)與參考的相似性來標(biāo)記新細(xì)胞。celldex R包提供了一種簡(jiǎn)單的方法來應(yīng)用SingleR包來注釋scRNA測(cè)序數(shù)據(jù),。分?jǐn)?shù)越高表示預(yù)測(cè)越準(zhǔn)確,，NK細(xì)胞被注釋為最高分。結(jié)果表明,，GSE142853的10個(gè)集群中有9個(gè)被注釋為NK細(xì)胞,，而一個(gè)集群被注釋為小膠質(zhì)細(xì)胞。NK和小膠質(zhì)細(xì)胞注釋都標(biāo)記為黃色,，表示更高的精度（圖6E）,。tSNE圖顯示3XTg-AD小鼠大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞和大多數(shù)NK細(xì)胞的比例非常小（圖6F）,。綜上所述,，GSE142853數(shù)據(jù)集證實(shí)了AD大腦中NK細(xì)胞的發(fā)生，一些浸潤(rùn)的循環(huán)NK細(xì)胞在AD大腦中被激活,。

圖6 AD腦中NK細(xì)胞的scRNA分析