福爾馬林固定石蠟包埋樣本（FFPE）因其易于長期保存，所以在臨床病理檢驗,、腫瘤基因檢測和醫(yī)學(xué)科學(xué)研究過程中多采用此種方法保存患者的組織樣本,。在利用二代測序技術(shù)進行精準(zhǔn)治療時，很大程度上依靠這些組織樣本。

然而,，由于腫瘤的異質(zhì)性和正常細(xì)胞的干擾,，腫瘤體細(xì)胞突變往往難以被發(fā)現(xiàn)。雖然二代測序技術(shù)可以進行深度測序,，找到低頻突變,，但有證據(jù)表明，在FFPE DNA樣本中檢測到的一些序列突變可能是樣本處理過程中遭受損傷所致^[1],。

為了減少序列假象（sequence artifacts）對腫瘤突變檢測結(jié)果的影響,，首先我們來了解一下DNA損傷有哪些類型。

圖1 FFPE DNA中存在的DNA損傷^[2]

（來源：Do, H. et al. | Clinical Chemistry ）

即大分子（如蛋白質(zhì)和核酸）兩兩之間發(fā)生交聯(lián),。甲醛導(dǎo)致DNA損傷的原因主要源自其羰基親電性和較小的空間位阻,，使其易于與核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)。在體外,，甲醛先與蛋白質(zhì)或核酸上自由的氨基反應(yīng)生成不穩(wěn)定的羥甲基加合物,，然后再進一步與其他核酸或蛋白質(zhì)反應(yīng)形成穩(wěn)定的交聯(lián)物^[3]。

在上述甲醛導(dǎo)致的各種交聯(lián)類型中,，主要形成DNA和組蛋白的交聯(lián),。這一過程是甲醛先快速的和組蛋白反應(yīng)，然后再和DNA外環(huán)的氨基結(jié)合形成DPC（即DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)）,。

在FFPE DNA樣本中存在C>U或C>T,。在體內(nèi)，胞嘧啶自發(fā)水解脫氨變成尿嘧啶,，發(fā)生頻率約為每個細(xì)胞每天190次,，可通過堿基切除修復(fù)恢復(fù)成胞嘧啶，而在體外則無法修復(fù),。此外,，CpG二核苷酸中的胞嘧啶水解脫氨，轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶,，產(chǎn)生T:G錯配,。

DNA分子丟失了嘌呤堿或嘧啶堿后形成的脫堿基位點。當(dāng)組織在福爾馬林中固定時,，福爾馬林中的甲醛在空氣中容易被氧化成甲酸，甲酸降低了福爾馬林的pH值,。而嘌呤堿基與糖骨架的N-糖苷鍵易于在低pH下發(fā)生水解,，致使DNA堿基脫落。此外,，脫堿基位點可以通過β-消除反應(yīng)進行自發(fā)切割,，導(dǎo)致DNA鏈斷裂。

FFPE DNA的片段化程度會隨著保存時間的延長和固定中使用的福爾馬林pH值的降低而增加。與來自新鮮FFPE DNA相比,，保存時間長的FFPE DNA進行PCR,，成功率較低。說明樣品在保存期間,，DNA片段化這一現(xiàn)象可能一直在發(fā)生,。

那么，想要獲得高質(zhì)量的FFPE DNA,，我們可以從以下方面“解救”DNA,。

1.1 中性福爾馬林固定液

正如前文中提到的，甲醛pH降低容易導(dǎo)致堿基脫落,，甚至是DNA斷裂,。有研究表明，將乳腺癌組織樣本同時用中性緩沖福爾馬林固定液和非緩沖福爾馬林固定液處理,，發(fā)現(xiàn)用中性福爾馬林固定液處理過的樣本DNA片段化較少^[4],。同時，中性緩沖福爾馬林固定液也可降低DNA交聯(lián)的發(fā)生,?；诖耍覀兺扑]使用10%中性福爾馬林固定液對組織樣本進行固定,。

圖2 不同福爾馬林緩沖液制備乳腺癌FFPE 

DNA的QC比率對比

（來源：Nagahashi, M. et al. | Journal of Surgical Research）

注：QC比率表示DNA質(zhì)量的相對量度,。

高QC比率表示DNA片段化較少，反之亦然,。

組織固定，組織塊不宜過大,。凡是需要固定的組織,，都不應(yīng)該太大太厚，這是因為所有的固定液穿透力不夠強,、浸透度不夠快的緣故,。如果較大較厚的組織，不經(jīng)處理就進行固定,，那么待固定液進入至中間,，可能這些組織早就發(fā)生自溶了。一般所取組織塊厚度建議不超過5mm,。

固定液量的足夠與否決定著組織固定的成敗,，推薦固定液體積應(yīng)為被固定標(biāo)本體積的5～10倍。根據(jù)標(biāo)本的大小選擇合適的體積,。若標(biāo)本過大,，可取些脫脂棉或紗布,，浸濕固定液后，蓋于組織表面,，以免組織被風(fēng)干,，影響制片效果。

組織樣本固定的時間通常不超過48小時,，根據(jù)組織樣本的體積控制固定時間,。通常活檢標(biāo)本為 6～24 h,；手術(shù)切除標(biāo)本為 12～48 h^[5],。極小的標(biāo)本，如穿刺樣本建議固定時間在4～6 h,。對于后續(xù)要進行二代測序的標(biāo)本,，固定時間不足，組織自溶,，核酸酶釋放,，核酸隨之降解；若固定時間太久,，核酸與核酸,、核酸與蛋白產(chǎn)生過多的交聯(lián)，在后續(xù)解交聯(lián)步驟后核酸產(chǎn)生較多損傷,，通過PCR擴增,，易產(chǎn)生假陽性突變。

石蠟作為組織包埋劑,，其溫度設(shè)置對DNA質(zhì)量有不同程度的影響,。一般盡量選擇低熔點蠟，且熔蠟的溫度設(shè)置為比熔點高2℃,，可使固體石蠟全部液化即可,。包埋用熔蠟的溫度應(yīng)<65℃，溫度太高,，DNA發(fā)生部分解鏈,，組織內(nèi)殘留的痕量甲醛可對解鏈后的DNA單鏈進行甲基化修飾，修飾后的DNA單鏈在冷卻后不易復(fù)性而導(dǎo)致降解,。

合適的蠟塊或切片存儲條件,，將會減緩DNA降解的速度。常規(guī)的FFPE樣本一般保存在室溫下,。有資料顯示,，當(dāng)FFPE樣本儲存在4℃時，DNA降解程度較低^[6],。

圖3 不同儲存溫度下蠟塊DNA完整性的比較

（來源：Daniel, G. et al. | Plos One ）

注：組織樣本來源于大鼠,。

2.1 脫蠟

由于石蠟可阻礙消化液對組織的滲透，從而抑制蛋白酶K與組織內(nèi)蛋白的接觸,，影響組織消化和DNA釋放,。所以在DNA提取過程中，脫蠟一定要徹底,。

目前,，二甲苯和環(huán)保脫蠟液都可用于FFPE樣本的脫蠟。用不同脫蠟液提取石蠟組織標(biāo)本DNA,，發(fā)現(xiàn)兩者并無明顯差異^[7],。二甲苯是一種有毒的有機試劑，在實驗過程中如果身體接觸到會有一定程度的危害,，且二甲苯脫蠟過程繁瑣,，實驗過程涉及到的試劑種類較多，容易出錯,，故推薦一步法脫蠟,。一步法脫蠟采用環(huán)保脫蠟液，使用安全,，且脫蠟和裂解消化同步加熱進行,，在省去中間離心去上清步驟的同時，又可避免蠟殘余導(dǎo)致消化不完全,。

圖4 不同脫蠟液提取FFPE DNA的純度,、濃度檢測結(jié)果

（來源：何燕 et al. | 臨床與實驗病理學(xué)雜志）

在消化過程中,，消化時間與溫度也會影響DNA提取質(zhì)量,。溫度過高不利于保護DNA，過低則不利于蛋白酶K消化,。一般認(rèn)為蛋白酶K的最適工作溫度為56℃,，而37℃則是大多數(shù)酶的最適反應(yīng)溫度。將37℃和56℃兩個溫度下蛋白酶K消化FFPE組織進行比較,，發(fā)現(xiàn)56℃消化獲得的DNA量較多,，且質(zhì)量較高^[8]。而消化時間從2小時到7天^[9]不等,，一般認(rèn)為適當(dāng)延長消化時間有利于DNA的提取,。具體消化時間可根據(jù)實驗需求調(diào)整，以組織消化徹底,，組織消化液清亮為準(zhǔn),，但是要保證在消化時間延長過程中穩(wěn)定酶濃度，每延長24h補加一次蛋白酶K,，確保消化徹底,。

2.3 其他因素

樣本提取過程中,，為了提高DNA的洗脫效果，可將DNA洗脫液提前放置37℃預(yù)熱5min,。

綜上,，我們知道，對于FFPE DNA樣本來說,，無論是交聯(lián),、堿基轉(zhuǎn)換、堿基脫落抑或是DNA片段化,，都是不可避免會發(fā)生的現(xiàn)象,。為了減少DNA損傷影響，需要采取相應(yīng)的措施來降低假突變風(fēng)險,。

就組織樣本而言,，取材結(jié)束后，就要對樣本進行固定,。固定一般采用10%中性福爾馬林固定液,，樣本厚度建議不超過5mm，固定液與組織的比例至少應(yīng)為5:1,，固定時間通常不超過48小時,。包埋時，盡量選擇低熔點蠟,，將包埋溫度設(shè)置成比熔點高2℃,。此外，制備好的蠟塊或切片置于常溫保存,，若條件允許的話,，置于4℃保存，效果更佳,。

在FFPE DNA提取過程中,，脫蠟是否徹底是提取高質(zhì)量DNA的重要步驟。推薦使用一步法脫蠟,。由于組織中DNA和蛋白質(zhì)相結(jié)合,，若想釋放充分的DNA，則需56℃消化2h或過夜消化,。同時,，通過提前37℃預(yù)熱洗脫液5min，也可提高DNA得率,。

參考資料：

1. Chen, L. , Liu, P. , Evans, T. C. , & Ettwiller, L. M. . (2017). dna damage is a pervasive cause of sequencing errors, directly confounding variant identification. Science, 355(6326), 752-756.

2. Do, H. , & Dobrovic, A. . (2015). Sequence artifacts in dna from formalin-fixed tissues: causes and strategies for minimization. Clinical Chemistry, 61(1), 64-71.

3. 吳凱. (2006). 甲醛與細(xì)胞內(nèi)DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的關(guān)系. 國家環(huán)境與健康論壇.

4. Nagahashi, M. , Shimada, Y. , Ichikawa, H. , Nakagawa, S. , Sato, N. , & Kaneko, K. , et al. (2017). Formalin-fixed paraffin-embedded sample conditions for deep next generation sequencing. Journal of Surgical Research, 220(48), 125.

5. 石遠(yuǎn)凱, 孫燕, 于金明, 丁翠敏, 王子平, & 王長利, et al. (0). 中國晚期原發(fā)性肺癌診治專家共識(2016年版). 中國肺癌雜志.

6. Daniel, G. , Christian, V. , Daniela, P. , Nadine, D. , Kurt, Z. , & Real, F. X. . (2018). Impact of storage conditions on the quality of nucleic acids in paraffin embedded tissues. PLOS ONE, 13(9).

7. 何燕, 王建東, 時姍姍, 章如松, 周曉軍, & 馬恒輝. (2013). 環(huán)保脫蠟液與二甲苯對石蠟包埋組織dna質(zhì)量影響的比較. 臨床與實驗病理學(xué)雜志, 29(2), 226-227.

8. 田子強, 劉俊峰, 張少為, 李保慶, 王福順, & 張月峰. (2004). 普通甲醛固定石蠟包埋組織dna提取方法的探討. 癌癥, 23(3).

9. Warford, A. , Pringle, J. H. , Hay, J. , Henderson, S. D. , & Lauder, I. . (1988). Southern blot analysis of dna extracted from formol–saline fixed and paraffin wax embedded tissue. Journal of Pathology, 154(4), 313.

以上,，就是本期想與大家分享的“獲取高質(zhì)量DNA”的小技能，你get到了嗎,？