位點特異性重組也稱保守性重組,,常發(fā)生在原核生物,。位點特異性重組發(fā)生在特殊的DNA序列對之間,依賴小范圍同源序列的聯(lián)會,,同時重組也只限于發(fā)生在這一小范圍,。 1.λ噬菌體DNA整合 1)整合位點的結構 整合通過λDNA和細菌DNA之間的位點專一性重組實現(xiàn),這些特定位點叫做附著位點,。細菌DNA上的附著位點稱為attB,大約長25bp,,位點bio和gal基因之間,分為B,、O,、B’3個序列組分。λ噬菌體的附著位點稱為attP.由P,、O和P’三個序列組成,,場240bp。attB和attP中兩側的B,、B’和P和P’,,P'稱為臂,,其序列結構各不相同,但兩者的O序列完全一致,,由15bp組成,,λDNA的整合和切利都發(fā)生在該序列,因此,,O序列也成為核心序列,。 2)λDNA的整合 λ噬菌體的DNA雙聯(lián)線狀結構,進入大腸桿菌細胞后通過首尾連接形成環(huán)狀DNA,。在λ噬菌體基因int的產物的結合酶(Int)和一個整合宿主因子IHF蛋白作用下,,λDNA上的POP'序列與大腸桿菌染色體上的BOB’序列實行同源聯(lián)會,然后通過雙方DNA分子的斷裂重接,,λ噬菌體的DNA整合到大腸桿菌DNA分子中,。整合到大腸桿菌DNA分子中的λ噬菌體成為原噬菌體,在λ原噬菌體DNA分子兩邊個形成一個att位點,,其中一個位點是attL,,序列組成是POB',兩個位點都是重組的產物。 在整合過程中,,首先兩個環(huán)狀DNA分子變成一個大環(huán),,然后attB和attP的核心序列(O序列)中的鏈斷裂與重接,在attP和attB位點上產生同樣的交錯接口,,形成5’—OH和3'-P的末端,,交錯切口的5’單鏈區(qū)為7bp,且attB和attP兩個核心區(qū)的斷裂完全相同。對特異性DNA具有強烈的親和力的Int與attP,,attB位點結合后,,利用其拓撲異構酶活性使DNA兩個雙鏈各自斷開一條單鏈瞬間旋轉后交換連接,形成Holliday中間體,。另外兩條單鏈通過相同的過程斷裂重接,,完成雙鏈間的重組。因此,,當整合反應發(fā)生時,即在attP和attB處發(fā)生交叉重組,,產生兩個較小的環(huán)狀DNA,。在整合過程中,4條鏈同時被切斷,,交叉,,然后磷酸二酯鍵又重新連接,期間沒有發(fā)現(xiàn)任何穩(wěn)定的中間產物,。 3)整合的酶學機制 Int是一種DNA結合蛋白,,對POP’序列有強的親和力,,只能催化BOB’和POP’之間的重組,不能催化BOP’與POB’之間的重組,,所以,,只有Int存在時,整合反應不可逆,。整合酶實際上起拓撲異構酶的作用,,使帶有att位點的超螺旋松弛,也可產生交錯的斷裂,,即有7個核苷酸的單鏈尾端,,形成黏性末端。 整合宿主因子IHF蛋白含兩個不同的亞單位,,該兩個亞單位分別被宿主的himA,,himD基因編碼。整合酶Int和IHF在att上有特定的結合位點,,每次重組過程需要20-40個整合酶分子及約70個IHF蛋白分子,。Int和IHF以協(xié)同的方式與att位點相結合,Int的結合位點有4個,,每個結合位點長約30bp,,而IHF的結合位點有3個,與Int和IHF與attP結合時,,形成一個復合物,,又稱“整合體”,在整合體中所有的結合位點都集中在蛋白寡聚體的表面,,此整合體的形成需要attP超螺旋,。 2.λ噬菌體DNA切離 如果λ原噬菌體受到誘導,整合作用將被逆轉,,此過程稱為切離,。切離后,細菌和噬菌體DNA恢復至原來狀態(tài),,λ噬菌體和細菌的att位點分別恢復為attP(POP')和attB(BOB'),。除了Int和IHF外,催化切離反應時,,還需一種由λ噬菌體xis基因編碼的切離酶Xis參加,。 位點特異性重組:①位點特異性重組屬于保守性重組,這種交換式可逆或向后的,,原先存在的DNA序列全部被保存下來,,沒有丟失;②噬菌體和細菌的DNA之間有一段很短的同源序列,,重組交換發(fā)生于該同源序列的一個特異性核苷酸,。 |
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