【原】易基因｜精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)：TERT啟動(dòng)子DNA甲基化在癌癥中的雙重作用

深圳易基因科技 2021-12-09

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精準(zhǔn)醫(yī)學(xué) | TERT啟動(dòng)子DNA甲基化在癌癥中的雙重作用

DNA甲基化是基因表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制，加拿大多倫多大學(xué)的Donghyun D. Lee團(tuán)隊(duì)從生物學(xué)和臨床角度討論TERT啟動(dòng)子DNA甲基化在腫瘤中雙重作用的最新進(jìn)展,，相關(guān)結(jié)果發(fā)表在2021年11月的J Clin Invest（14.808）期刊上,。

縮略詞：

TERT：端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase）

THOR：TERT高甲基化腫瘤區(qū)域（TERT hypermethylated oncological region）

DAM：特異性等位基因甲基化（differential allelic methylation）

THOR-DAM：TERT高甲基化腫瘤區(qū)域特異性甲基化

TPM：TERT啟動(dòng)子突變（TERT promoter mutations）

ARMS-PCR：擴(kuò)增突變系統(tǒng)PCR（amplification refractory mutation system PCR）

研究背景

端粒是染色體末端核蛋白結(jié)構(gòu)，可維持基因組穩(wěn)定性和預(yù)防癌癥,。而癌細(xì)胞可以通過(guò)激活端粒維持機(jī)制來(lái)復(fù)制腫瘤細(xì)胞,，通過(guò)端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT) 的異常表達(dá)來(lái)激活端粒酶是癌癥最普遍的端粒維持機(jī)制。癌癥TERT異常表達(dá)的特定驅(qū)動(dòng)因素有很多,，包括轉(zhuǎn)錄激活因子,、TERT拷貝數(shù)變異、TERT啟動(dòng)子突變（TERT promoter mutations ,TPM）,、啟動(dòng)子遠(yuǎn)端區(qū)域TERT高甲基化腫瘤區(qū)域（TERT hypermethylated oncological region,THOR）等,，但這些因素如何在癌癥中獨(dú)立或合作地激活TERT異常表達(dá)仍未完全了解。

研究方法

作者收集了各種組織的575個(gè)腫瘤樣本和77個(gè)正常組織樣本（Table 1）,，進(jìn)行基因組DNA/RNA制備,、重亞硫酸鹽PCR和NGS測(cè)序，對(duì)基因組DNA(100ng)進(jìn)行重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化,，使用不同的引物組對(duì)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化DNA中的靶向擴(kuò)增子進(jìn)行PCR擴(kuò)增（擴(kuò)增子引物不與CpG位點(diǎn)重疊）,。隨后對(duì)測(cè)序reads進(jìn)行比對(duì)和等位基因特異性甲基化(differential allelic methylation，DAM)分析,，比較等位基因DNA甲基化模式,。

Table1：General characteristics of the human tissue samples

THOR-DAM標(biāo)準(zhǔn)：[A1]

(a) 一個(gè)等位基因高甲基化 (>16.0%)，另一個(gè)等位基因低甲基化 (<16.0%)

(b) 腫瘤樣本低甲基化和高甲基化等位基因之間的平均甲基化差異大于 8.2%

ARMS-PCR：

鑒定啟動(dòng)子SNP（pSNP,rs2853669,A或G）與外顯子SNP（exSNP,rs2736098,C或T）相關(guān)堿基,。

ddPCR的相對(duì)TERT表達(dá)：

從每個(gè)組織或細(xì)胞系中提取總RNA,，并將1μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用數(shù)字液滴PCR（digital droplet PCR, ddPCR）分析每個(gè)cDNA樣品（50ng）,，探針靶向相同的外顯子SNP（exSNP,，rs2736098），ddPCR結(jié)果通過(guò)Sanger對(duì)cDNA樣品的測(cè)序得到雙重確認(rèn),。

報(bào)告基因表達(dá)分析：

使用單因素方差分析（1-way ANOVA）評(píng)估報(bào)告基因表達(dá)的顯著性,，Dunnett’s post hoc test進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)矯正。

研究結(jié)果

癌癥中的THOR-DAM富集

為了研究TERT啟動(dòng)子等位基因特異性DNA甲基化的存在,，作者評(píng)估了10種不同癌癥類型的575個(gè)腫瘤組織和77個(gè)正常組織樣品,，對(duì)THOR區(qū)域（Chr5:1295321-1295393，覆蓋THOR區(qū)域的7個(gè)CpG位點(diǎn)）共同的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（rs2853669,，啟動(dòng)子SNP或pSNP,，Chr5:1295349，GRCh37/hg19）進(jìn)行下一代測(cè)序（NGS）和reads比對(duì),。

其中286個(gè)腫瘤和34個(gè)正常組織含有雜合pSNP（含有“A”SNP或“G”SNP的等位基因）,，在所有腫瘤類型中“A”和“G”等位基因（δ甲基化）之間的甲基化差異分析結(jié)果顯示：正常組織等位基因的甲基化差異不明顯,，平均差異為2.7%；癌癥組織的平均等位基因甲基化差異更為顯著,，范圍從腦膜瘤的3.0%到結(jié)腸癌樣本的29.7%,，“A”和“G”等位基因之間的高甲基化率無(wú)明顯差異。與正常組織相比,，結(jié)腸癌,、乳腺癌、黑色素瘤,、膀胱癌和膠質(zhì)瘤等腫瘤類型的平均差異等位基因甲基化明顯較高,。

為定義和評(píng)估THOR-DAM，作者制定兩個(gè)嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)：（a）一個(gè)等位基因高甲基化 (>16.0%),，另一個(gè)等位基因低甲基化 (<16.0%),；（b）腫瘤樣本低甲基化和高甲基化等位基因之間的平均甲基化差異大于 8.2%?；诖藰?biāo)準(zhǔn),，將腫瘤區(qū)分為THOR-DAM 和non-DAM，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常組織中THOR-DAM很少被觀察到（3%,，1/34）,，而在腫瘤組織中則很常見(jiàn)（29.0%，83/286）,。且THOR-DAM在不同癌癥類型中非隨機(jī)分布,，發(fā)病時(shí)間短的腫瘤類型呈THOR低甲基化，而從低級(jí)（癌前）發(fā)展到高級(jí)（惡性）,、發(fā)病時(shí)間長(zhǎng)的腫瘤類型前期THOR一個(gè)等位基因高甲基化，導(dǎo)致高DAM率,，進(jìn)而導(dǎo)致THOR雙等位基因高甲基化,。

TERT啟動(dòng)子突變（TPM）高發(fā)于黑色素瘤、成人膠質(zhì)瘤和膀胱癌,，這些腫瘤表現(xiàn)出最大的平均等位基因甲基化差異和最高的THOR-DAM率（分別為53%,，67%和60%）（圖1，C和D）,，表明THOR-DAM可能在TPM中富集,。

Prevalence of THOR-DAM in human cancer.
(A) Schematic of the TERT promot...

Figure 1：Prevalence of THOR-DAM in human cancer

TPM背景下的THOR-DAM

根據(jù)TPM狀態(tài)將所有腫瘤樣本分成兩組（WT vs TPM）評(píng)估THOR-DAM率,，結(jié)果顯示TPM組的THOR-DAM率比WT組明顯更高,。作者通過(guò)分析神經(jīng)膠質(zhì)瘤亞群（n=21）中的單個(gè)測(cè)序read，進(jìn)一步研究了THOR等位基因特異性甲基化水平,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)WT膠質(zhì)瘤都表現(xiàn)出相似的等位基因甲基化模式,，其中兩個(gè)等位基因都低甲基化,，表明近端THOR雙等位基因低甲基化。而TPM膠質(zhì)瘤存在非隨機(jī)高甲基化,。

Association between THOR-DAM and TPM in human cancer.
(A) Pie chart indi...

Figure 2：Association between THOR-DAM and TPM in human canc

THOR-DAM和等位基因特異性TERT表達(dá)

為了研究THOR-DAM在TPM和non-TPM情況下對(duì)TERT等位基因特異性表達(dá)的功能影響，作者選取啟動(dòng)子（pSNP,，rs2853669）和外顯子2（exSNP,，rs2736098）區(qū)域共11個(gè)癌細(xì)胞系（5個(gè)TPM和6個(gè)WT）（Table 2）的等位基因特異性甲基化特征（基于pSNP）與TERT表達(dá)（基于exSNP）進(jìn)行關(guān)聯(lián)模型,。作者使用擴(kuò)增突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system,ARMS）PCR確定pSNP（A/G,，區(qū)分特異性甲基化）和exSNP（C/T，區(qū)分特異性表達(dá)）的特異性關(guān)聯(lián),。結(jié)果顯示除LnCAP外，所有細(xì)胞系均表現(xiàn)出TERT的單表達(dá),。

Table 2：General characteristics of the human cancer cell li

使用靶向NGS測(cè)序評(píng)估核心TERT啟動(dòng)子（Chr5:1295313-1295395,，GRCh37/hg19）和近端抑制性THOR（repressive THOR，rTHOR,，Chr5:1295395-1295524,，GRCh37/hg19）的等位基因特異性甲基化模式。結(jié)果顯示在TPM癌細(xì)胞中,，攜帶雜合TPM（黃線）的等位基因在核心TERT啟動(dòng)子內(nèi)低甲基化,，在遠(yuǎn)端rTHOR中高甲基化，平均甲基化水平為35%（圖3A）,；no-TPM等位基因（紅線）在整個(gè)核心TERT啟動(dòng)子和rTHOR區(qū)域都被高甲基化,，且無(wú)任何TERT轉(zhuǎn)錄激活。

Allele-specific CpG methylation patterns of the TERT promoter in TPM and...

Figure 3：Allele-specific CpG methylation patterns of the TE

TERT啟動(dòng)子DNA甲基化在癌癥中的雙重作用

最后,，作者通過(guò)功能和機(jī)制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明等位基因特異性高甲基化在TERT啟動(dòng)子中的雙重作用,。當(dāng)與低甲基化近端核心啟動(dòng)子結(jié)合時(shí)，THOR高甲基化可增強(qiáng)TERT表達(dá),，而核心TERT啟動(dòng)子的高甲基化抑制了包括THOR高甲基化和TPM在內(nèi)的激活變化,。

Proposed model of epigenetic regulation of TERT in human cancer.
Normal ...

Figure 5：Proposed model of epigenetic regulation of TERT in

易基因小結(jié)

作者從10種癌癥類型中篩選了大量正常組織和腫瘤組織（n=652），確定了THOR區(qū)域的差異等位基因甲基化（differential allelic methylation,，DAM）僅存在于癌組織中,。THOR-DAM在成人癌癥中常見(jiàn)，且在含有激活性TERT啟動(dòng)子突變（TERT promoter mutations ,TPM）的腫瘤中富集,。功能研究顯示,，在TPM和TERT WT癌癥中,，TERT的等位基因特異性基因表達(dá)需要核心啟動(dòng)子的低甲基化。然而,，具有低甲基化核心TERT啟動(dòng)子的表達(dá)基因普遍表現(xiàn)出THOR高甲基化,。總之研究結(jié)果表明,，TERT啟動(dòng)子等位基因特異性DNA甲基化在調(diào)節(jié)癌癥TERT表達(dá)中具有雙重作用,。