這是醫(yī)業(yè)觀察公眾號(hào)的第1011-3期文章

作者：壇毛肚

來(lái)源：毛肚吃狗糧的筆記本

PACE蛋白定向進(jìn)化系統(tǒng)介紹

Phage-Assisted Continuous Evolution (PACE)，噬菌體輔助連續(xù)進(jìn)化系統(tǒng),，是由DavidR. Liu實(shí)驗(yàn)室在2011年發(fā)表的一項(xiàng)利用噬菌體和宿主大腸桿菌連續(xù)共培養(yǎng)策略來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)定向進(jìn)化的系統(tǒng),。

在邏輯層面，這套系統(tǒng)的原理是：將感興趣的蛋白質(zhì)或者酶（POI）的編碼核酸序列放進(jìn)噬菌體中,，在侵染大腸桿菌后利用其細(xì)胞內(nèi)的易錯(cuò)體系產(chǎn)生POI突變體文庫(kù),，只有符合預(yù)期進(jìn)化方向的突變體才能被保留，并繼續(xù)侵染大腸桿菌,；同時(shí),，利用一個(gè)液路控制系統(tǒng)使以上步驟不間斷的重復(fù)進(jìn)行，直到得到理想突變體為止,。

簡(jiǎn)言之,，這套系統(tǒng)通過(guò)改造生物學(xué)組件，耦合了POI核酸序列和功能的關(guān)系以及噬菌體依賴(lài)大腸桿菌復(fù)制存活的機(jī)制,。

接下來(lái)詳解PACE系統(tǒng)

生物學(xué)原理,。

所需要理解的基本要點(diǎn)：

a.噬菌體

此系統(tǒng)使用的是溫和噬菌體M13，在宿主大腸桿菌中復(fù)制,，但不會(huì)裂解宿主,；經(jīng)過(guò)改造，去除了M13基因組中的gⅢ基因,，此基因是M13侵染宿主的必須原件,；之后，在此位置用POI代替,，也就是在gⅢ啟動(dòng)子調(diào)控下轉(zhuǎn)錄和表達(dá)POI,。（要點(diǎn)：POI在噬菌體中攜帶）

b.宿主大腸桿菌

經(jīng)過(guò)改造，此系統(tǒng)使用的宿主大腸桿菌會(huì)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)M13噬菌體所缺失的gⅢ基因,，要點(diǎn)：大腸桿菌中g(shù)Ⅲ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)強(qiáng)度是由POI的活性決定的,；此外，宿主大腸桿菌裝配有易錯(cuò)系統(tǒng),，在阿拉伯糖操縱子調(diào)控下,，誘導(dǎo)表達(dá)若干個(gè)酶，他們可以引起宿主內(nèi)所有核酸在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生突變,。

c.POI活性是如何決定gⅢ基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)強(qiáng)度

這種生物學(xué)事件的邏輯耦合是case by case設(shè)計(jì)的,，目前可以完成的蛋白類(lèi)型包括：核酸聚合酶序列特異性改變、DNA結(jié)合蛋白序列特異性改變,、蛋白質(zhì)可溶性改變,、蛋白酶切割序列特異性改變,、蛋白質(zhì)互作特異性改變、基因編輯特異性改變,、翻譯過(guò)程中非天然氨基酸耐受性改變等,。

這里以核酸聚合酶序列特異性改變?yōu)槔?，具體講解,。

目標(biāo)：讓T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）識(shí)別T3啟動(dòng)子序列。

步驟一：進(jìn)化起點(diǎn)選擇

這個(gè)實(shí)施例中最理想的情況是T7 RNAP 是唯一的“變量”,，但實(shí)際上出現(xiàn)了兩個(gè)問(wèn)題：第一,，這個(gè)人為構(gòu)造的系統(tǒng)會(huì)“進(jìn)化”其中所有的原件；第二,，進(jìn)化的目標(biāo)和起點(diǎn)之間的距離太過(guò)遙遠(yuǎn),，系統(tǒng)始終無(wú)法找到進(jìn)化“方向”。（比喻：讓猩猩直接進(jìn)化成智人很困難）

為了解決以上問(wèn)題,，首先,，在不連續(xù)的條件下總裝了所有“原件”，讓原件之間互相“磨合”,，發(fā)生一些適應(yīng)性的突變,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)T7 RNAP P314T會(huì)發(fā)生突變，并且活性與野生型沒(méi)有顯著性差異,，故選擇此突變?yōu)镻OI的起點(diǎn),；其次，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)法直接使用T3啟動(dòng)子序列與T7 RNAP進(jìn)行連續(xù)進(jìn)化,，得不到有效突變體,，所以將T3和T7啟動(dòng)子進(jìn)行雜化，讓T7 RNAP對(duì)目標(biāo)不覺(jué)得那么陌生（比喻：先將猩猩進(jìn)化成古猿）,。

步驟二：系統(tǒng)設(shè)計(jì)

此系統(tǒng)主要是由蠕動(dòng)泵控制,，組成一個(gè)噬菌體與大腸桿菌共培養(yǎng)系統(tǒng)。

從左至右,，C端持續(xù)補(bǔ)充大腸桿菌培養(yǎng)基,，在B瓶中持續(xù)培養(yǎng)大腸桿菌，在兩個(gè)A中平行進(jìn)行噬菌體POI的進(jìn)化（兩個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)）,，由兩個(gè)針筒向A中供給誘導(dǎo)劑阿拉伯糖,。

系統(tǒng)的實(shí)際情況：

所有組件都是實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備和耗材。

經(jīng)過(guò)以上操作,，此系統(tǒng)可以正常啟動(dòng)“進(jìn)化”,。

步驟三：進(jìn)化結(jié)果

在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)從系統(tǒng)中采樣，并進(jìn)行測(cè)序和活性測(cè)試,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化池中產(chǎn)生了非常多的突變組合,，他們產(chǎn)生了不一樣的進(jìn)化路徑,，但在終點(diǎn)192小時(shí)，產(chǎn)生了5個(gè)共有的點(diǎn)突變,，并且對(duì)活性有影響,。

這為在時(shí)間尺度上研究酶進(jìn)化的動(dòng)態(tài)過(guò)程提供了前所未有的便利。

最終,，在兩個(gè)進(jìn)化池中都得到了可以識(shí)別T3啟動(dòng)子的T7 RNAP,。

此外，研究者還使用PACE系統(tǒng)進(jìn)化出可以啟動(dòng)非GTP的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的T7 RNAP,，并且活性與野生型相當(dāng),。

步驟四：一些重要參數(shù)

此實(shí)施例耗時(shí)8天，對(duì)POI來(lái)說(shuō),，大約進(jìn)行了200輪進(jìn)化,，噬菌體被稀釋10的167方倍，復(fù)制約555次,，在終點(diǎn)得到帶有11個(gè)點(diǎn)突變的活性突變體,。

近日，研究者應(yīng)用PACE系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行了定向進(jìn)化,，使其可以切割非靶向蛋白序列,。

首先，也是最重要的,，是建立蛋白酶活性（POI）與噬菌體復(fù)制能力之間的邏輯關(guān)系,。

這里使用了T7 RNAP的自抑制機(jī)制，將T7 lysozyme通過(guò)一個(gè)linker與T7 RNAP連接,，linker的序列為蛋白酶目標(biāo)識(shí)別序列,。

當(dāng)T7 RNAP linker lysozyme復(fù)合物完整時(shí)，T7 RNAP沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性,；

當(dāng)linker被蛋白酶水解,，lysozyme釋放，復(fù)合物解散,，T7 RNAP活性恢復(fù),。

進(jìn)一步，為了排除進(jìn)化得到的蛋白酶產(chǎn)生的脫靶,，此實(shí)施例引入了負(fù)向篩選機(jī)制,。

將linker設(shè)計(jì)為不希望被切割的靶序列，同時(shí)將gⅢ修改為gⅢ-negative,，一種gⅢ的截短體,，其具有顯性負(fù)性能力，即如果出現(xiàn)了脫靶切割的情況,，此類(lèi)population不會(huì)繼續(xù)復(fù)制,。

為了驗(yàn)證負(fù)選擇機(jī)制的可行性，研究者對(duì)X蛋白酶實(shí)施了進(jìn)化,。

X蛋白酶的天然底物至少有6種，目標(biāo)是保留其中的兩種底物特異性,，降低其他4種的特異性。此處為了豐富突變體庫(kù),，先使用了不連續(xù)進(jìn)化的方法PANCE,，可以在96孔板中高通量的、嚴(yán)謹(jǐn)性可調(diào)的產(chǎn)生突變體文庫(kù),。

最終產(chǎn)生了X突變體4130B1,，其相較于野生型,，對(duì)Ykt6的活性提高了1.5倍,，對(duì)VAMP1、-2或-3的活性降低了700倍,；以及突變體5010B1對(duì)VAMP1的催化效率降低了85倍,，對(duì)VAMP4提高了2.5倍。

這些結(jié)果驗(yàn)證了PANCE陽(yáng)性和陰性雙重選擇系統(tǒng)進(jìn)化系統(tǒng)的選擇能力,。

之后研究者還對(duì)其他兩種蛋白酶實(shí)施了進(jìn)化,，改變了他們的底物特異性。

總結(jié)與展望

1,，PACE和PANCE系統(tǒng)的進(jìn)化能力已經(jīng)接近“全自動(dòng)”化,，這在商業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化中很有優(yōu)勢(shì)；

2,，此系統(tǒng)可以開(kāi)發(fā)為自動(dòng)化設(shè)備,，類(lèi)似于AKATA，并配以耗材和kit,，向用戶(hù)賦能,；

3，需要開(kāi)發(fā)更直觀,、便捷的表征方法來(lái)檢測(cè)進(jìn)化的實(shí)時(shí)進(jìn)行程度,；

4，在研發(fā)流程上,，分子生物學(xué) 生物信息學(xué) 結(jié)構(gòu)生物學(xué)的整合模式已經(jīng)非常明顯且有效,；

文章僅代表作者本人觀點(diǎn)，與醫(yī)業(yè)觀察立場(chǎng)無(wú)關(guān),。文章圖片均來(lái)源于網(wǎng)絡(luò),，如有侵權(quán)，請(qǐng)聯(lián)系作者刪除,歡迎聯(lián)系小編,。 @今日話題