這兩年,，隨著外泌體研究的火熱,，miRNA的研究又變得多樣化，而研究miRNA最基本的,，莫過于設(shè)計miRNA的引物啦,。今天我給大家介紹最常用的莖環(huán)法設(shè)計引物。

miRNA引物設(shè)計（莖環(huán)法）原理：由于miRNA在23bp左右,，沒法根據(jù)其設(shè)計引物檢測出來,，于是，我們可以將其延長，也就是先加一個環(huán)狀片段,，這樣就使得原來23bp左右的延伸為80bp左右了,，然后就可以根據(jù)這個80bp片段設(shè)計引物啦。

以has-miR-145為例設(shè)計引物,，其成熟體序列為：GUCCAGUUUUCCCAGGAAUCCCU,。每個反向引物都帶有一段固定的序列，可以形成一個莖環(huán),。固定序列為：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG-3’,。

在這個序列后加上八個堿基，這八個堿基是has-miR-145從后面數(shù)八個堿基的反向互補序列,，就是GAAUCCCU的反向互補：AGGGATTC,最后得到的反向引物的序列為：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAG AGGGATTC-3’

正向引物：每個正向引物也帶有一段固定的序列,，固定序列為：

ACACTCCAGCTGGG

在這個序列后加上成熟體除后面六個外剩下的堿基序列，成熟體除后面六個堿基序列為：GUCCAGUUUUCCCAGGA,，把U變成T即可,，最后的序列為：5’-ACACTCCAGCTGGG GTCCAGTTTTCCCAGGA-3’

這樣我們就得到has-miR-145的正向F引物和反向R引物啦。在做實驗時,，用R引物將RNA逆轉(zhuǎn),，再用F+R跑PCR就行啦。

當然,，直接在莖環(huán)上取一段即可設(shè)計跑PCR的下游通用引物,。如：

5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA -3，這個就更簡單了,，不過本人還是用特異性逆轉(zhuǎn)錄引物比較多,。

U6的正反向引物分別為

F-CTCGCTTCGGCAGCACA；

R-AACGCTTCACGAATTTGCGT,。