碳點(diǎn) (CDs),，作為一種新型的碳基納米材料,，以其超小尺寸,、高穩(wěn)定性和高生物安全性等優(yōu)點(diǎn),，廣泛應(yīng)用于傳感,、器件,、藥物載體及疾病診療等領(lǐng)域中。近年來(lái),，有研究報(bào)道顯示CDs具有特殊的類酶活性,，表現(xiàn)出產(chǎn)生或清除自由基 (ROS) 的能力。其中,，實(shí)現(xiàn)或提高CDs清除ROS的策略主要有兩種：1）通過(guò)引入大量的含氧官能團(tuán),，利于ROS與材料之間形成加和物和電子轉(zhuǎn)移；2）通過(guò)摻雜金屬離子或雜原子促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移,。然而,，上述兩種策略難以實(shí)現(xiàn)對(duì)多種自由基的同時(shí)、高效清除且存在一定的生理毒性,。因此,，如何構(gòu)建無(wú)金屬摻雜的CDs實(shí)現(xiàn)體內(nèi)ROS的高效、快速清除仍有待進(jìn)一步探索。

基于此,，安徽大學(xué)畢紅教授,、中科院寧波材料技術(shù)與工程研究所吳愛(ài)國(guó)研究員、合肥工業(yè)大學(xué)查正寶教授合作研究了一種具有高效類酶活性的無(wú)摻雜CDs (e-CDs),。在體外實(shí)驗(yàn)中,，合成的e-CDs對(duì)各種陰/陽(yáng)離子自由基均表現(xiàn)出良好的清除能力。此外,，通過(guò)構(gòu)建d-半乳糖誘導(dǎo)的衰老小鼠模型,，證實(shí)了e-CDs具有良好的抗衰老能力。該工作為進(jìn)一步通過(guò)簡(jiǎn)便,、高效的合成策略開發(fā)各種新型具有高效類酶活性的CDs提供了有價(jià)值的見解,，并為納米材料在抗衰老藥物中的應(yīng)用提供了新的思路。

該研究成果以Inhibition of oxidative stress in vivo through enzyme-like activity of carbon dots為題發(fā)表在 Applied Materials Today 上,。安徽大學(xué)董晨博士為該文的第一作者,。

透射電子顯微鏡 (TEM) 圖像顯示e-CDs呈單分散狀態(tài)，平均直徑為4.8 nm (圖1a),。隨后,，進(jìn)一步利用傅立葉變換紅外吸收光譜儀 (FT-IR) 和X射線光電子能譜 (XPS) 研究了e-CDs的化學(xué)組成與結(jié)構(gòu)。FT-IR圖譜中 (圖1b),，位于1347 cm-1和1588 cm-1處的特征峰分別對(duì)應(yīng)于C-O和C=O鍵的伸縮振動(dòng),，而3389 cm-1處的特征峰為-OH的伸縮振動(dòng)。XPS分析結(jié)果表明e-CDs主要由碳 (285.3 eV) 和氧 (530.2 eV) 兩種元素組成,，對(duì)應(yīng)的原子含量分別為68.1%和31.9% (圖1c),。此外，C 1s 的高分辨能譜 (圖1d) 具有位于284.6 eV,、286.7 eV和288.9 eV的特征峰,，可分別歸屬于C-C/C=C、C-O和C=O鍵,；O 1s的高分辨能譜 (圖1e) 具有C=O (531.8 eV)和C-O (535.7 eV) 鍵的對(duì)應(yīng)信號(hào)峰,。上述FT-IR 和XPS結(jié)果表明，e-CDs 表面由豐富且多樣的官能團(tuán)與化學(xué)鍵組成,。UV-vis光譜中出現(xiàn)了210 nm和283 nm的特征峰,，可分別歸屬于π-π?和n-π?躍遷 (圖1f)。

圖1. e-CDs的 (a) TEM圖像, (b) FT-IR和 (c) XPS光譜; (d) HR XPS C1s和 (e) O1s譜及其擬合結(jié)果; (f) e-CDs的UV-vis光譜及相應(yīng)的PL光譜,。

通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)MMT比色法對(duì)e-CDs的細(xì)胞毒性作了初步評(píng)價(jià) (圖2a),。從結(jié)果可以看出，e-CDs分別與HepG2細(xì)胞和HUVEC細(xì)胞共培育24 h后,，隨著 e-CDs 濃度的不斷增大,，細(xì)胞活性略有下降,，但兩種細(xì)胞的存活率均高于80%，該結(jié)果說(shuō)明e-CDs 對(duì)人源正常細(xì)胞和癌細(xì)胞均表現(xiàn)出較小的細(xì)胞毒性,。此外,，LDH法也是一種檢測(cè)樣品細(xì)胞毒性的方法，如圖2b所示,，e-CDs造成HepG2細(xì)胞和 HUVEC細(xì)胞內(nèi)的LDH 釋放量呈濃度依賴性,，最大釋放量均低于 300 U L-1，該結(jié)果也進(jìn)一步證明了e-CDs 對(duì)細(xì)胞膜的損傷較小,，這與 MTT比色法測(cè)定的結(jié)果保持一致,。隨后，利用H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激評(píng)估e-CDs是否能夠保護(hù)HUVEC細(xì)胞 (圖2c),。用300 μmol L-1H2O2培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,，可使細(xì)胞活力降低約50%。而在培養(yǎng)基中加入e-CDs后,，細(xì)胞活力梯度增加,。當(dāng)e-CDs濃度增加到300 μg mL-1時(shí)，與對(duì)照組相比,，細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著差異,，表明在培養(yǎng)過(guò)程中幾乎沒(méi)有產(chǎn)生ROS。此外,，DCFH-DA熒光探針,、活/死細(xì)胞染色和流式細(xì)胞儀測(cè)試結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了e-CDs對(duì)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷具有明顯的保護(hù)作用 (圖2d-f)。此外,，e-CDs對(duì)HUVEC細(xì)胞中丙二醛 (MDA),、谷胱甘肽 (GSH) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 水平的影響，表明e-CD具有良好的ROS清除作用,，能保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷 (圖2g-i)。

圖2. (a)不同濃度e-CDs共孵育HUVEC和HepG2細(xì)胞24 h后的MTT結(jié)果; (b) 不同濃度 e-CDs處理的HUVEC和HepG2細(xì)胞釋放LDH的結(jié)果; (c) e-CDs對(duì)氧化應(yīng)激HUVEC細(xì)胞的保護(hù)作用; (d) DCFH-DA探針對(duì)HUVEC細(xì)胞的熒光染色圖像; (e) 分別用Calcein-AM和PI染色的活,、死HUVEC細(xì)胞熒光圖像; (f) 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS水平; e-CDs對(duì)HUVEC細(xì)胞中 (g) MDA, (h) GSH和 (i) SOD的影響,。

受體外氧化應(yīng)激抑制作用啟發(fā)，通過(guò)構(gòu)建d-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠模型評(píng)價(jià)e-CDs體內(nèi)抗衰老能力 (圖3a),。連續(xù)口服e-CDs治療30 d后,，采集各組小鼠的血液及相應(yīng)組織。從測(cè)定d-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠血清和肝臟中MDA,、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶 (GSH-Px),、過(guò)氧化氫酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD) 水平結(jié)果來(lái)看，隨著e-CDs濃度的增加,，小鼠的氧化損傷得到有效緩解 (圖3b-e),。與此同時(shí),，免疫組化染色結(jié)果顯示d-半乳糖可加速小鼠衰老，而e-CDs可減少凋亡蛋白,，增加抗凋亡蛋白的形成,，緩解小鼠腦/肝臟組織細(xì)胞凋亡，從而緩解機(jī)體衰老 (圖3f,g),。隨后,，進(jìn)一步觀察并分析了各組小鼠皮膚組織的病理形態(tài) (圖3h,i)?？梢郧宄赜^察到對(duì)照組中小鼠皮膚彈性纖維排列整齊,，細(xì)長(zhǎng)，呈交織或網(wǎng)狀,。相比之下,，d-半乳糖誘導(dǎo)的氧化損傷小鼠皮膚組織中膠原纖維明顯減少，排列不規(guī)則,，部分區(qū)域破碎稀疏,，是老齡化特征的典型表現(xiàn)。經(jīng)e-CDs治療后,，小鼠皮膚組織中的膠原纖維得到一定程度的改善,。膠原纖維多呈波狀，排列有序,，密度提高,。說(shuō)明e-CDs治療可在一定程度上減輕d-半乳糖所致小鼠皮膚組織的老化損傷，維持正常的生理結(jié)構(gòu)和形態(tài),。

圖3. (a) 小鼠氧化損傷模型構(gòu)建示意圖; e-CDs對(duì)氧化損傷小鼠血清和肝組織中 (b) MDA, (c) GSH-Px, (d) CAT和 (e) SOD水平的影響; e-CDs對(duì)氧化損傷小鼠 (f) 海馬體和 (g) 肝臟中Bax,、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響; e-CDs對(duì)氧化損傷小鼠皮膚組織中 (h) 彈性纖維和 (i) 膠原纖維含量的影響。

本文來(lái)源：碳點(diǎn)之光