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作者開(kāi)發(fā)了一種改良的人體腸類(lèi)器官培養(yǎng)條件,，可提高培養(yǎng)效率并保持其長(zhǎng)期多向分化能力,。人類(lèi)小腸隱窩和類(lèi)器官的scRNA-seq結(jié)果表明，在精細(xì)條件下培養(yǎng)的器官中可以保留體內(nèi)細(xì)胞多樣性,。文章采用多種技術(shù)：基因表達(dá)芯片,、生長(zhǎng)因子篩選、克隆形成實(shí)驗(yàn)等技術(shù)揭示胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF-2）的聯(lián)用增強(qiáng)了人類(lèi)腸道干細(xì)胞的克隆形成能力和CRISPR基因組工程效率,。該組合同樣能夠長(zhǎng)期培養(yǎng)一系列腸類(lèi)器官,，包括大鼠小腸類(lèi)器官。本文重點(diǎn)介紹單細(xì)胞測(cè)序部分,，主要是細(xì)胞分群注釋結(jié)果,。

人：三名患者的腸病灶樣本；另一名患者正常組織對(duì)照

樣本處理

• 新鮮樣本：將一個(gè)病人回腸組織樣本剪碎,、過(guò)濾、分選除去死細(xì)胞,，得到EpCAM（上皮細(xì)胞粘附分子）抗體標(biāo)記的細(xì)胞,。

• 類(lèi)器官樣本：在IF（combination of IGF-1 and FGF-2 ）條件下維持超過(guò)六個(gè)月并在指定條件下擴(kuò)增10天得到人回腸類(lèi)器官，經(jīng)單細(xì)胞解離和DAPI染色后,，分選得到活的單細(xì)胞,。

建庫(kù)

• 10x genomics公司建庫(kù)試劑盒Single Cell 3’ Library & Gel Bead Kit

• 測(cè)序平臺(tái)：Illumina HiSeq 4000  

數(shù)據(jù)處理

使用CellRanger（版本2.1.1）將序列數(shù)據(jù)比對(duì)到人類(lèi)基因組（GRCh38）上；將UMI（獨(dú)特分子標(biāo)識(shí)符）計(jì)數(shù)矩陣導(dǎo)入R（版本3.5.1）并使用R包Seurat（版本2.3.4）進(jìn)行處理(Satija et al., 2015) ,；對(duì)于類(lèi)器官數(shù)據(jù),，去除線(xiàn)粒體讀數(shù)<1％或> 10％的所有細(xì)胞,；通過(guò)Seurat包的NormalizeData函數(shù)獲得對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)值。通過(guò)Seurat包的ScaleData函數(shù)中用的負(fù)二項(xiàng)回歸校正每個(gè)細(xì)胞的總UMI計(jì)數(shù)和線(xiàn)粒體讀數(shù)的比例,。通過(guò)使用每個(gè)細(xì)胞的總UMI計(jì)數(shù)和轉(zhuǎn)錄物長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)化,，從原始UMI計(jì)數(shù)獲得FPKM值（轉(zhuǎn)錄物的每千堿基片段比對(duì)到每百萬(wàn)reads數(shù)）；用R包dbscan（版本1.1-2）實(shí)現(xiàn)DBSCAN聚類(lèi)過(guò)濾掉88個(gè)非上皮細(xì)胞,。

用Seurat包中的RunPCA函數(shù)執(zhí)行線(xiàn)性降維,；用Seurat包中的FindVariableGenes函數(shù)選擇作為可變表達(dá)的基因；用Seurat軟件包的FindClusters函數(shù)中建立SNN（基于共享最近鄰居）模塊化的集群,，使用前25個(gè)主成分（PCs）構(gòu)建SNN圖,；T-SNE圖由Seurat包中的RunTSNE函數(shù)使用前25個(gè)PCs生成。

通過(guò)Wilcoxon rank sum test比較每個(gè)簇和其他簇,，進(jìn)行差異表達(dá)基因（DEG）分析,，分析中包括scaled dispersion> 0.25且 log-normalized average expression> 0.01的基因；通過(guò)Benjamini-Hochberg方法計(jì)算FDR（假陽(yáng)性率）,，并使用0.01的FDR閾值,；對(duì)于每個(gè)簇，具有前100倍變化的DEGs被認(rèn)為具有細(xì)胞類(lèi)型特征,，如果細(xì)胞類(lèi)型特征基因在不同的簇之間重疊,，則將基因分配給具有最高表達(dá)值的簇。

用R包randomForest 運(yùn)算

使用新鮮隱窩和類(lèi)器官中的干細(xì)胞,，早期E細(xì)胞和E細(xì)胞的scRNA-seq數(shù)據(jù),。在分析之前，使用R package scran（版本1.8.4）中的mnnCorrect函數(shù)執(zhí)行相互最近鄰（MNN）批量校正(Haghverdi et al., 2018)  ,。使用R bioconductor package destiny（版本2.10.2）(Angerer et al., 2016) 中的DiffusionMap函數(shù)進(jìn)行擴(kuò)散映射分析,。

分選細(xì)胞后用選定的因子組合進(jìn)行類(lèi)器官培養(yǎng)

細(xì)胞分群注釋

單細(xì)胞結(jié)果：得到新鮮細(xì)胞2254個(gè)，類(lèi)器官I(mǎi)F（IGF-1 and FGF-2 (IF)  ）培養(yǎng)細(xì)胞2872個(gè),，類(lèi)器官ES（EGF and p38i ）培養(yǎng)3790個(gè),。左圖為t-SNE聚類(lèi)，右圖為基因表達(dá)特征,。大多數(shù)分群與已知腸細(xì)胞類(lèi)型的特征性基因表達(dá)模式能夠關(guān)聯(lián)起來(lái),，包括 LGR5+ stem cells, cycling transit amplifying (TA) 細(xì)胞, 早期和成熟腸細(xì)胞, goblet cells,以及Paneth cells，SOX4 + / POU2F3 +簇絨細(xì)胞與早期腸內(nèi)分泌細(xì)胞聚集在一起,，并且激素分泌腸內(nèi)分泌細(xì)胞由于其數(shù)量少而不形成明顯的群,。值得注意的是，IF培養(yǎng)的類(lèi)器官含有新鮮隱窩中鑒定到的大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型,，包括LGR5 +干細(xì)胞,，TA細(xì)胞，早期腸細(xì)胞,，goblet細(xì)胞和M細(xì)胞,，以及腸內(nèi)分泌細(xì)胞,。相反，ES培養(yǎng)的類(lèi)器官主要由對(duì)應(yīng)于LGR5 +干細(xì)胞,，TA細(xì)胞和早期腸細(xì)胞的三種細(xì)胞類(lèi)型組成（E, enterocyte; EEC, enteroendocrine; TA, transit amplifying. TA cells are classified into TA1 and TA2 based on differing cell cycle phases ）,。

基因表達(dá)情況

來(lái)自IF培養(yǎng)的人小腸類(lèi)器官的92個(gè)腸內(nèi)分泌細(xì)胞中的腸內(nèi)分泌相關(guān)基因的表達(dá)（log10 [FPKM + 1]。通過(guò)無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)將腸內(nèi)分泌細(xì)胞分為enteroendocrine cell progenitors (EEC prog.), nterochromaffin (EC) cells, L cells, and early L cells,。

維持人類(lèi)腸類(lèi)器官中的分化細(xì)胞類(lèi)型具有令人驚訝的挑戰(zhàn),，因?yàn)樗鼈儑?yán)重依賴(lài)抑制分化的生長(zhǎng)因子。在IF條件下,，人體腸道類(lèi)器官始終表現(xiàn)出多種分化和自我更新的能力,，為了全面和直接的驗(yàn)證這一特征，文章首次進(jìn)行了人類(lèi)腸上皮的大規(guī)模scRNA-seq,。scRNA-seq提供了人類(lèi)成人小腸上皮細(xì)胞類(lèi)型的概要,，以及培養(yǎng)類(lèi)器官常規(guī)或精制培養(yǎng)的條件。

與其他文章比起來(lái),，這篇文章主要利用單細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分群,。