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作者：王 珺 劉 超 石瑛琪 單位：杭州杰毅生物技術有限公司 基于二代測序技術（next generation sequencing,，NGS）或稱高通量測序技術的病原微生物宏基因組檢測（metagenomics next generation sequencing，mNGS）是新近發(fā)展起來的一種快速,、高通量的獲得核酸序列信息的技術,，在過去10年極大的推動了人類微生態(tài)學研究和微生態(tài)對人體健康影響的理解。自2014年在新英格蘭醫(yī)學雜志上首次報道一例用二代測序技術診斷鉤端螺旋體感染的病例以來,，其診斷價值已迅速被認可[1],。由于常見病原微生物均含有核酸，mNGS通過核酸序列可明確病原體的種類甚至部分耐藥基因信息,，另外由于其超高靈敏度,、檢測周期快和非培養(yǎng)依賴能力且不受人類基因組DNA干擾等優(yōu)點，mNGS已作為一種新興和強大的技術用于醫(yī)學微生物學,，可能成為一種快速的,、普適的感染性疾病病原體的診斷方法。 相比常規(guī)的分子生物學技術如熒光定量PCR,，mNGS的實驗流程也更復雜,，操作環(huán)節(jié)多，對試劑質(zhì)控,、實驗室污染控制和人員的專業(yè)技術要求更高,。本文對mNGS檢測及相關實驗要求作探討。 1.生物安全要求：待測樣本中可能含有較高傳染性的病原微生物,，因此樣本處理區(qū)需要有嚴格的分區(qū)和負壓,，需要具備II級生物安全柜。廢棄樣本,、廢液處理應制定相應的操作程序,，所有的危險性廢棄物必須依照統(tǒng)一的容器和標示方式，完整并且合規(guī)地標示廢棄物內(nèi)容,。建議參照國家衛(wèi)生健康委辦公廳頒布的新型冠狀病毒實驗室生物安全指南（第二版）對廢棄物進行處理[2],。2.人流物流嚴格分區(qū)：因為mNGS的建庫方案和操作流程不同，對于實驗室的布局要求不同,。如果建庫環(huán)節(jié)包含PCR擴增,，需嚴格按照核酸擴增實驗室管理辦法管理。如果采取靶向多重PCR擴增建庫（一般需進行兩輪PCR）,，則需要有試劑準備區(qū),、樣本制備區(qū)、擴增區(qū)、擴增后區(qū),、樣本制備二區(qū)、擴增二區(qū),、擴增后二區(qū)等兩套獨立的PCR實驗室分區(qū),，盡可能降低PCR氣溶膠造成的交叉污染。mNGS檢測靈敏度高,，在布局上不得與微生物培養(yǎng)在同一個實驗分區(qū)進行實驗,。3.人員能力要求：實驗室應具備分子生物學實驗背景的技術人員，推薦獲得國家要求的相應資質(zhì),，微生物實驗資質(zhì),、基因擴增實驗資質(zhì)。實驗室具備生物信息分析能力,，熟悉數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu),、更新數(shù)據(jù)庫、對于新發(fā)病原體進行全基因組拼接等,。審核人員需具備臨床醫(yī)學、微生物學,、高通量測序背景知識,。mNGS可以分為鳥槍法宏基因組測序,、16S測序和靶向測序三大類,。鳥槍法宏基因組測序（shotgun sequencing）：對樣本中提取的所有核酸進行無偏倚的建庫和測序,，測序結(jié)果過濾人源序列,，再與已知的微生物數(shù)據(jù)庫比對，進行屬種鑒定,。可以檢測所有已知基因序列的微生物,，包含細菌、真菌,、病毒,、寄生蟲[3]。16S測序（16S rRNA Sequencing）：根據(jù)細菌基因組上高度保守的編碼核糖體蛋白的16S rDNA基因序列設計通用引物,，對可變區(qū)（V3和V4）進行擴增,，獲得平均450bp的擴增片段，再通過建庫測序獲得每個樣本不低于5萬條序列,。為了簡化運算，將這些標簽序列進行聚類，生成數(shù)百個OTUs（最小可分類單元）,，通過和RDP（核糖體數(shù)據(jù)庫計劃）數(shù)據(jù)庫的比對分類,。該方法主要針對細菌,，不適用于真菌、病毒,、寄生蟲等病原體[4],。 靶向測序（tNGS）：針對已知基因序列的幾十-幾百種微生物設計多重PCR引物或核酸探針,，對樣本提取的核酸進行靶向富集,，富集后的核酸進行常規(guī)建庫測序。因為只針對目標微生物進行建庫測序,，數(shù)據(jù)量只需1~2M reads,。該方法主要適用于定向的微生物panel,，覆蓋范圍較小[5],。1.樣本前處理：對液化（痰液）,、破壁（勻質(zhì),、超聲）、離心、去宿主/去人源等樣本前處理操作和使用的儀器設備應進行充分的性能驗證,。mNGS檢測需要盡可能覆蓋所有病原微生物,，因此樣本前處理步驟需要考慮同時兼顧真菌,、結(jié)核、胞內(nèi)菌等難破壁的病原體,，以及支原體,、衣原體、病毒等相對易破壁的病原體,。mNGS是無偏倚,、無差別的對所有核酸進行測序，每份臨床樣本中都同時包含宿主核酸與病原核酸,，有觀點認為需要針對樣本中的人源細胞或核酸進行去除,，從而提高對微生物的檢測敏感性,。目前常用的去除人源宿主的方法有：過濾法,、甲基化抗體捕獲法和選擇性裂解法[6-8],。其中過濾法是基于病原體和宿主細胞體積差異進行去除,，但由于真核細胞,、寄生蟲等病原體和人類細胞體積大小近似,，過濾法并不太常用,。甲基化抗體捕獲通過人基因組核酸中廣泛存在的甲基化修飾對人的核酸進行去除,，但是真菌,、寄生蟲等真核病原體的核酸同樣具有甲基化，會在這一步驟中被去除,，因此使用范圍受到較大限制,。相比之下,，選擇性裂解的原理是通過人細胞和病原體不同的理化性質(zhì)，通過溫和的變性劑處理優(yōu)先裂解人細胞（沒有細胞壁，較容易破裂），再通過離心富集病原體,。選擇性裂解法具有方便快捷,、微生物損失小等優(yōu)點，目前被廣泛采用,。但值得注意的是，某些病原體的理化性質(zhì)與人細胞相似,，比如肺炎鏈球菌,，可能會在去人源的過程中丟失,。目前并沒有一套完善的去人源流程,，已發(fā)表的技術方法都各有優(yōu)缺點。去人源處理雖然可以提高病原體檢測的敏感性，但同時也會顯著增加背景微生物的干擾,，因此需要對去人源技術進行充分的驗證,，本指南不建議對所有臨床樣本都進行去人源處理。2.破壁和提?。?/span>（1）微生物破壁：mNGS檢測靈敏度的關鍵是對樣本內(nèi)的微生物進行充分的破壁,，以釋放出核酸,。因此實驗室需對破壁與核酸提取進行驗證，需涵蓋難破壁（隱球菌,、結(jié)核,、曲霉）和易破壁（鏈球菌,、病毒等）兩大類混合病原微生物。應采用培養(yǎng)后滅活的真實微生物（病毒可以使用假病毒替代）或微生物標準品（中國食品藥品檢定研究院）,。常用的破壁手段有超聲破碎和玻璃珠勻質(zhì)破碎,。為了避免樣本間的交叉污染，不能使用探頭接觸式超聲儀器,。玻璃珠破碎法需要對采購的玻璃珠的容量,、粒徑大小進行驗證。（2）核酸提?。簃NGS檢測涉及不同的樣本類型,，實驗室應根據(jù)待檢標本的特點，建立針對性的標準化提取程序,，推薦使用經(jīng)性能驗證和確認的商業(yè)化提取試劑和設備,。針對血漿游離DNA，需采用游離DNA提取試劑,，特異性富集血漿中的小片段游離DNA,。其他類型樣本則使用基因組DNA提取試劑。臨床有些樣本需進行RNA檢測,，因此也需對不同試劑和儀器的RNA提取效率進行驗證和評估,。3.文庫構(gòu)建：DNA測序主要涉及兩種建庫類型：血漿游離DNA和基因組DNA。大部分游離DNA片段在200bp以內(nèi),，因此無需針對血漿游離DNA進行片段化[9],。基因組DNA在建庫時需要進行片段化處理（超聲打斷或酶切法）,。RNA測序則需要進行逆轉(zhuǎn)錄步驟,，把樣本中的RNA分子逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，在逆轉(zhuǎn)錄完成后需要進行片段化處理,。（1）文庫構(gòu)建的基本流程包括：DNA片段化,、末端補平加A、接頭連接,、核酸純化,、PCR擴增、核酸純化[10],。核酸純化需要有轉(zhuǎn)管操作,，建議采用低吸附耗材, 以及盡量避免不必要的核酸純化步驟，降低轉(zhuǎn)管污染風險,，減少核酸損失,。為了避免mNGS的假陽性，在建庫過程中需要對可能的污染（樣本間污染、環(huán)境微生物或其核酸的污染）進行監(jiān)控,。如果建庫過程包含PCR擴增,，需嚴格遵守臨床基因擴增實驗室規(guī)范。推薦采用核酸純化步驟少,，無PCR擴增環(huán)節(jié)（PCR-free）的建庫方案,。（2）自動化文庫構(gòu)建：mNGS對時效性的要求較高，同時對污染又非常敏感,，因此建議采用自動化程度高,、封閉式建庫儀器，盡可能把濕實驗流程在封閉的儀器內(nèi)自動完成,。如果建庫中需要使用PCR擴增,，需嚴格按照核酸擴增實驗室要求在擴增室進行，不建議在建庫儀器內(nèi)進行PCR,，否則極易發(fā)生氣溶膠污染[11],。PCR擴增后的文庫不得返回樣本制備區(qū)，因為核酸純化需要對PCR擴增后的產(chǎn)物進行開管操作,，因此必須在擴增后室進行,。如果選用具有PCR功能的NGS自動工作站，建議使用兩臺完成濕實驗流程：一臺工作站在樣本制備區(qū),，完成核酸提取,、片段化、補平加A,、接頭連接,、純化等步驟。文庫進入在擴增室進行PCR,，擴增產(chǎn)物進入擴增后室,，使用另一臺NGS工作站完成后續(xù)操作。采用無PCR擴增環(huán)節(jié)（PCR-free）的建庫方案除可規(guī)避PCR氣溶膠污染和PCR偏好性外,，也使NGS自動化全流程可在一臺NGS自動工作站完成,。實踐證明，采用PCR-free建庫方案的NGS自動工作站（如杰毅生物NGSmaster）相比手工操作能大幅降低外源微生物污染可能性[12],。1.測序平臺評估：對于采用的測序儀需要從以下幾個方面進行綜合評估：測序速度,、最長讀長、錯誤率,、數(shù)據(jù)通量,。測序速度：mNGS檢測對于時效性要求高,，完成最短50bp讀長的測序時間不能長于16小時,。最長讀長：mNGS具備檢測已知微生物，以及未知微生物能力。長越長有利于病原體的基因組拼接,，最長讀長不應低于100bp,。測序錯誤率：堿基測序錯誤率要求不高于1%。數(shù)據(jù)量：目前尚缺乏系統(tǒng)研究不同樣本類型需要的測序數(shù)據(jù)量,。國外文獻報道集中在6~10M reads左右,，國內(nèi)共識建議采用20M數(shù)據(jù)量。2.測序平臺種類：mNGS檢測的測序平臺主要來自illumina,、ThermoFisher及華大基因,，以及單分子測序平臺Oxford Nanopore。二代測序（以Illumina平臺為代表）的測序通量大,，每次測序可以產(chǎn)生幾千萬甚至幾十億條序列,，測序錯誤率低，讀長一般在50~300bp之間,，目前illumina,、華大基因、ThermoFisher等儀器平臺已經(jīng)獲得NMPA注冊證,。單分子測序（或稱為三代測序,，以Oxford Nanopore平臺為代表）的讀長，在菌種鑒定和耐藥基因檢測相比二代測序具有優(yōu)勢,，但測序錯誤率較高,，通量低，直接用于臨床樣本的宏基因組測序需要去人源或多重PCR建庫等微生物富集處理,，性能還需充分驗證,。3.不同測序平臺的測序原理：illumina：可逆末端終止測序法（Sequencing By Synthesis，SBS）：采用每次延伸一個堿基,，堿基上帶有不同熒光顏色以及末端終止基團,，測序完成后，會把熒光基團淬滅,，并去除終止基團,，繼續(xù)進行下一步測序。illumina平臺目前常用的測序平臺有NextSeq（NextSeq Dx,，NextSeq CN500,，NextSeq 550AR），MiSeq Dx,，Novaseq,，iSeq等平臺。 華大基因：DNA納米球測序技術（DNBSEQ）通過儀器氣液系統(tǒng)先將 DNA納米球（DNA nanoball, DNB）泵入到規(guī)則陣列芯片（Patterned Array）并加以固定,，然后泵入測序模板及測序試劑,。測序模板與芯片上的DNB的接頭互補雜交，在DNA聚合酶的催化下，測序模板與測序試劑中的帶熒光標記的探針相結(jié)合,。然后由激光器激發(fā)熒光基團發(fā)光,，不同熒光基團所發(fā)射的光信號被相機采集，經(jīng)過處理后轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號,，傳輸?shù)接嬎銠C進行處理,，可以獲取待測樣本的堿基序列信息。DNBSEQTM測序技術主要包括: DNA單鏈環(huán)化和DNB制備,，規(guī)則陣列芯片（Patterned Array）,，DNB 加載，cPAS （combinatorial Probe Anchor Synthesis 聯(lián)合探針錨定聚合測序法）, 雙端測序技術,，以及配合的流體和光學檢測技術和堿基識別算法等,。cPAS已經(jīng)廣泛地應用于BGISEQ-500，BGISEQ-50,，MGISEQ-200,，MGISEQ-2000以及DNBSEQ-T7等測序平臺。Oxford Nanopore：納米孔測序（Nanopore）核心DNA建庫的時候加上分子馬達,，將DNA牽引通過電阻膜上的納米孔蛋白,，核酸通過納米孔的時候會引起電阻膜上電流的變化，通過捕獲電流變化來識別堿基,。納米孔測序的特點,，讀長長，可以到幾十kb,，病原體鑒定容易,，更易做耐藥檢測，但納米孔測序缺點是通量低,，樣本需要進行去人源技術才能進行全面檢測,。4. 測序要求：mNGS檢測需要涵蓋數(shù)萬種病原體數(shù)據(jù)庫，測序后所得序列和數(shù)據(jù)庫進行對比,。因此測序讀長不建議短于50bp,。讀長過短會導致難以鑒定到物種水平。測序數(shù)據(jù)量應保證每個文庫10M reads,。在測序時間上,，測序時間應不超過15小時，樣本處理+測序總時間建議小于24小時,。注：本文來源于《臨床實驗室》雜志2021年第3期“微生物與感染”專題
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