病原宏基因組檢測(metagenomics next generation sequencing, mNGS)通過對臨床樣本中提取的總核酸進(jìn)行無偏倚的鳥槍法測序，測序結(jié)果首先過濾人源序列,，再和已知的微生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對,，匯報樣本中的微生物屬種和序列數(shù)（最佳比對或嚴(yán)格比對到某微生物屬/種的核酸片段數(shù)）。2014年,，加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的Charles Chiu團(tuán)隊首次采用高通量測序技術(shù)（NGS,，Next Generation Sequencing）成功地對一位患有聯(lián)合免疫缺陷綜合征，由鉤端螺旋體引起腦膜炎的臨床患者提供病原學(xué)診斷和治療[1],，隨后,，針對病原微生物的metagenomic Next Generation Sequencing（mNGS）檢測技術(shù)逐漸在臨床廣泛應(yīng)用，尤其是針對免疫抑制感染患者的診斷[2],。

因為mNGS的無偏倚特性,，理論上樣本中所有微生物的核酸都可以檢測，因此mNGS可以實現(xiàn)一萬種以上病原微生物（細(xì)菌,、病毒,、真菌、寄生蟲）的鑒定,，具有常規(guī)靶向病原學(xué)檢測（微生物培養(yǎng),、抗體/抗原、PCR）所不具備的廣覆蓋優(yōu)點。但正是由于這種特點,，在樣本采集、運輸,、濕實驗等過程中引入的外源微生物或其核酸的污染（exogenous microbial contamination）會對mNGS報告和解讀造成干擾,。即便采用規(guī)范化的全流程無菌操作（無活體微生物），外源微生物的核酸污染依然存在[3],。此外,，人體開放性部位的標(biāo)本（比如口咽拭子、痰液,、肛周拭子等）中往往存在大量條件致病微生物的定植和共生,，如何對微生物的定植和感染進(jìn)行判別，從而明確責(zé)任病原體,，是mNGS結(jié)果解讀中需要注意的另一個重要問題[4],。本文對mNGS結(jié)果解讀的相關(guān)要求作探討。

對微生物共生和定植的解讀需要考慮標(biāo)本采集部位和宿主免疫狀態(tài),。比如免疫正?；颊叩暮粑罉颖局袡z測出非結(jié)核分枝桿菌，一般考慮定植,，而長期吸煙,、COPD、支氣管擴(kuò)張或免疫抑制患者檢測出非結(jié)核桿菌,，應(yīng)考慮感染,。同理，如果肺泡灌洗液中檢出惠普爾養(yǎng)障體（惠普爾病的病原體）,，在解讀報告時,，應(yīng)結(jié)合患者臨床信息，考慮是否患有肺部基礎(chǔ)疾病,，CT影像是否符合放線菌感染（粟粒樣結(jié)節(jié),、肉芽腫等），是否合并其他微生物感染（比如結(jié)核分枝桿菌）等,，對惠普爾養(yǎng)障體的致病性進(jìn)行綜合評估,。

mNGS匯報微生物的閾值通?；谛蛄袛?shù)（reads）或根據(jù)測序數(shù)據(jù)量標(biāo)化后的序列數(shù)（RPM,，reads per million reads，相對于每百萬條序列的數(shù)值）進(jìn)行設(shè)定,。然而,，鳥槍法宏基因組測序的原理是對文庫中的核酸進(jìn)行無偏好性的等比例抽樣（unbiased proportional sampling）,，最終測序的片段占文庫中所有核酸片段的千分之一甚至更低，因此mNGS對樣本中微生物的檢測性能取決于兩個因素：人源核酸含量與病原核酸含量,，人源核酸含量越高,，微生物的檢測性能越差。人源核酸含量高的樣本中,，含量相同的微生物reads數(shù)或RPM會低于人源核酸含量低的樣本,。因此單純通過reads數(shù)或RPM作為檢出微生物的匯報閾值可能存在一定的問題。舉例說明：膿腫抽液（通常人源核酸含量較高）和腦脊液（通常人源核酸含量較低）在提取建庫后都測得10M reads（一千萬條序列）,，假設(shè)兩份標(biāo)本中都含有金黃色葡萄球菌，序列數(shù)均為100,。因為前者的人源核酸含量遠(yuǎn)大于后者,，雖然金葡的序列數(shù)相同，但金葡在膿腫抽液中的實際含量要遠(yuǎn)大于腦脊液,。因此,，reads數(shù)或RPM不應(yīng)作為mNGS匯報閾值的唯一標(biāo)準(zhǔn)。建議在不同類型樣本中加入已知含量的內(nèi)參定量核酸（internal quantitative reference）,，既可以對提取建庫流程進(jìn)行質(zhì)控,，也可以對樣本中的人源和微生物核酸進(jìn)行相對定量，可以使用相對定量的數(shù)值進(jìn)行微生物匯報閾值的設(shè)置（同類樣本中的相對定量數(shù)值可以直接比較,，而序列數(shù)不可以）,。

對絕對致病,，或致病性明確的微生物而言,，陽性檢出一般認(rèn)為是責(zé)任病原體，比如腺病毒,、冠狀病毒,、結(jié)核分枝桿菌、利什曼原蟲等,。這里需要注意的是,，樣本間的交叉污染可能會導(dǎo)致假陽性，比如建庫流程中的PCR擴(kuò)增,，有可能造成氣溶膠污染,，尤其當(dāng)并行測序的某個文庫中含有較高豐度的微生物時，氣溶膠污染會更加顯著,。需要在實驗和生物信息分析環(huán)節(jié)對可能的交叉污染進(jìn)行質(zhì)控和過濾,，每次實驗后需要嚴(yán)格執(zhí)行實驗室清潔和通風(fēng)。在建庫方法的選擇上,，可以考慮采用無PCR擴(kuò)增的建庫技術(shù)（PCR-free library preparation）,，最大程度降低PCR氣溶膠造成的影響[5],。相比之下，條件致病微生物的陽性檢出并不代表致病,，臨床解讀必須結(jié)合樣本,、微生物特點，以及患者信息進(jìn)行綜合評估,，包括樣本采集部位,、宿主基礎(chǔ)疾病、免疫狀態(tài),、抗生素使用和耐藥信息,、常規(guī)病原學(xué)檢測結(jié)果等。

mNGS與傳統(tǒng)的病原學(xué)檢測（比如微生物培養(yǎng)）相比,，具有覆蓋廣、檢出率高的優(yōu)勢,。以外周血檢測為例,，常規(guī)血培養(yǎng)的陽性率低于10%，而mNGS的陽性率一般在30-40%左右,。然而,，在臨床懷疑感染而mNGS檢測結(jié)果為陰性時，需要考慮以下因素：a) 患者癥狀由非感染性因素引起,。以不明原因發(fā)熱（FUO）為例,，致病因素可以大致分為四類：感染性疾病、非感染性炎癥,、腫瘤和其他疾病,。當(dāng)mNGS結(jié)果為陰性時，需要考慮非感染性疾病的可能性,；b) 送檢樣本不合理,，未遵循靠近病灶部位取樣的原則（比如肺部感染送檢外周血），或檢測項目選擇不正確（比如RNA病毒感染,，但只進(jìn)行了DNA測序）,；c) 樣本人源核酸含量過高，造成假陰性,，不同樣本中的人源核酸含量不一樣,，以肺泡灌洗液（每毫升中有核細(xì)胞數(shù)為10^5個）和外周血（每毫升中有核細(xì)胞數(shù)為(4 ~ 10)×10^6個）為例，計算其在25M reads下含不同微生物拷貝數(shù)時的檢測靈敏度,。結(jié)果顯示,，如要達(dá)到87.5%以上的靈敏度，每毫升BALF中至少需含有10個目標(biāo)拷貝數(shù),，而每毫升血液中至少需含有400個目標(biāo)拷貝數(shù),。（mNGS理論最低檢測限計算方法：假設(shè)環(huán)境中所有核酸的長度為G,，檢測其中片段的大小為M，將基因組隨機(jī)打斷,，從里面抽取一條序列,，正好來至于待檢片段的概率為M/G，抽取n條序列,，至少有一條序列來至于待檢片段的概率為1 - (1-M/G)^n,。假設(shè)環(huán)境中所有的核酸由k個不同基因組大小Gk的片段組成，每個基因組在環(huán)境中的拷貝數(shù)為Ck,，假定待檢片段M=C0G0,，環(huán)境中總核酸G=∑ Ci Gi。當(dāng)樣本中含有高背景人源DNA時,，G≈背景基因組大小乘以背景細(xì)胞拷貝數(shù)=C1G1,。檢測n條序列其中包含1條以上目的片段的敏感性為：1 - (1-M/G)^n =1 - (1-C0G0/ ∑i=1,k CiGi)^n ≈ 1 - (1-C0G0 / C1G1)^n）。

參考文獻(xiàn)略

注：本文來源于《臨床實驗室》雜志2021年第3期“微生物與感染”專題