答：一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖,，只有兩端篩板孔徑不對(duì)稱(chēng)的柱子不能反沖,，不過(guò)目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見(jiàn)了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,，反沖后還是正著用比較好,，以免柱子的兩頭都被污染，我們一直提倡的是：正向使用,，反向沖洗,。

2.我在做方法開(kāi)發(fā)的時(shí)候,用乙腈和水作為流動(dòng)相,在調(diào)整梯度的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，剛開(kāi)始用60%乙腈,，RT為2.5分鐘,，調(diào)到40%乙腈,，RT沒(méi)有變化，30%也沒(méi)有變化,，一直調(diào)到20%的時(shí)候,，RT突然變到了約13分鐘，請(qǐng)問(wèn)這是什么原因,？我用的是離子交柱,。

答：離子交換柱的保留時(shí)間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定，你現(xiàn)在講的比較簡(jiǎn)單,，需要把你的方法說(shuō)的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析,。譬如，分析物是什么情況,，其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì),？離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì)？水相是什么緩沖鹽,？

3.對(duì)于一根常用的C18柱,，拿到一根新柱的時(shí)候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)？為什么要這樣做,？

答：新柱活化,，實(shí)際上是一個(gè)平衡的過(guò)程，除了用流動(dòng)相平衡外,，有時(shí)候還必須用所測(cè)樣品對(duì)新柱進(jìn)行平衡,，特別是測(cè)定分子量比較高的多肽，尤其重要,。因?yàn)?，分子量高的物質(zhì)分子，擴(kuò)散速度慢,，平衡所需時(shí)間也相應(yīng)較長(zhǎng),。具體平衡方式也很簡(jiǎn)單，多進(jìn)幾次樣品,，直到峰面積和保留時(shí)間穩(wěn)定,，再進(jìn)行正式進(jìn)樣測(cè)定。

如果要加快平衡時(shí)間,，把前面用來(lái)平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大,，或者不等洗脫完成，連續(xù)進(jìn)樣多針,。用待測(cè)物對(duì)新柱平衡,，目的是：將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉。

4.測(cè)定多肽,，一般采用什么柱子,？流動(dòng)相是乙腈和水,，還有微量的TFA。特別是像類(lèi)似三肽的短肽,，應(yīng)該怎么選擇柱子,？

答：分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測(cè)定，也有用離子交換柱,、水性C18柱和Hilic親水作用柱的,。

5.氨基柱在進(jìn)酸性樣品時(shí)，很傷柱子,，如使用一段時(shí)間后,，柱效降低，峰形改變,，如何恢復(fù),？

答：氨基柱測(cè)酸性樣品,，應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式,。酸的存在可能會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，導(dǎo)致使用一段時(shí)間后對(duì)于某些類(lèi)的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降,。建議：用5～10倍的柱體積的含0.5～1.0％NH₃的乙腈-水(50：50)溶液沖洗該柱（沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動(dòng)相洗去多余氨）,，之后，再進(jìn)行分析這類(lèi)酸性分析物時(shí)建議在流動(dòng)相中略微添加少許氨如,，0.1％,。

6.色譜柱的技術(shù)都有哪些？比如,，封尾等,，這些技術(shù)在應(yīng)用時(shí)都體現(xiàn)在哪里？

答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),，填料技術(shù)自不待言,，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單,，不同固定相,、不同粒徑、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度,，裝柱工藝都有所不同,，要裝出緊密、穩(wěn)定,、均一的柱床,，更多是一門(mén)藝術(shù)，需要經(jīng)驗(yàn)積累,。

7.色譜柱技術(shù)的差距在哪里,？

答：色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),，填料技術(shù)自不待言，填料的好壞對(duì)色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響,。裝柱技術(shù)也沒(méi)有想象中的這么簡(jiǎn)單,，不同固定相、不同粒徑,、不同柱管內(nèi)徑和長(zhǎng)度,，裝柱工藝都有所不同，要裝出緊密,、穩(wěn)定,、均一的柱床，更多是一門(mén)藝術(shù),，需要經(jīng)驗(yàn)積累,。

國(guó)內(nèi)和國(guó)外相比，我認(rèn)為色譜柱的差距在于：國(guó)內(nèi)公司以前都不會(huì)自己開(kāi)發(fā)填料,，一般買(mǎi)國(guó)外現(xiàn)成填料裝柱,，買(mǎi)到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里。另外,，因?yàn)?，裝柱歷史短，經(jīng)驗(yàn)積累少,，裝柱工藝也沒(méi)有完全達(dá)到國(guó)外水平,。另外，對(duì)色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料——裸硅膠,，國(guó)產(chǎn)的還不過(guò)關(guān),，在純度、粒徑和孔徑的均一性方面和國(guó)外產(chǎn)品相比,，差距很大,。

8.柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢？原來(lái)也討論過(guò)這個(gè)問(wèn)題,，我也拆下來(lái)清洗過(guò),，但我看到柱前段的污染更甚，于是就用刀片刮了刮,，然后把清洗好的篩板安裝上去,。問(wèn)題解決了，但使用壽命會(huì)不會(huì)減少呢,？

答：柱頭污染了,，就取出污染的，再裝一些填料,。因?yàn)?，加入你刮了些填料,，那么微觀的塔板數(shù)就少了。假入你刮得不多,，僅表面,，可能就是一些臟物，所以,，問(wèn)題解決,，但是，今后還會(huì)有同樣問(wèn)題,，再掛,，那么不小心刮，影響柱效,。建議還是裝一個(gè)預(yù)柱,。

9.如果柱子取下來(lái)放置一段時(shí)間，需要做什么保護(hù)嗎,？

答：對(duì)一般的反相柱,，也就是洗干凈后放到純甲醇（乙腈）或者是80%左右的甲醇（乙腈）水中，然后用堵頭塞緊柱兩頭,，以免保存溶劑揮發(fā),，應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù),。

10.流動(dòng)相中加入適量的四氫呋喃可以改善峰形的機(jī)理是什么,？

答：《高效液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說(shuō)：甲醇為質(zhì)子給予體、乙腈為質(zhì)子接受體,、四氫呋喃是偶極溶劑,，應(yīng)該除了極性影響，還有另外的影響因素,，至于分離機(jī)理,，還是比較復(fù)雜的，不能看成是個(gè)萬(wàn)能方法,。

11.關(guān)于色譜柱的填裝問(wèn)題,！我個(gè)人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況：

①?lài)?guó)外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣(mài)到國(guó)內(nèi)；

②國(guó)外生產(chǎn)填料,，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售,；

③國(guó)內(nèi)生產(chǎn)填料，國(guó)內(nèi)填裝銷(xiāo)售,。

一般情況下,，第1種情況賣(mài)的最貴，也質(zhì)量最好,！可是我就不明白了：如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話,，那么填裝上國(guó)內(nèi)也跟不上去嗎,？為什么換在國(guó)內(nèi)填裝就會(huì)出現(xiàn)或多或少的一些小問(wèn)題呢？

答：國(guó)內(nèi)填裝會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量小問(wèn)題,，和國(guó)內(nèi)目前普遍做事沒(méi)有國(guó)外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧,。如果工藝技術(shù)上沒(méi)有問(wèn)題，又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施,，國(guó)內(nèi)填裝和國(guó)外填裝并無(wú)區(qū)別,。

12.國(guó)產(chǎn)色譜柱在市場(chǎng)上占有比例如何啊,？

答：國(guó)內(nèi)色譜柱市場(chǎng)還沒(méi)有人進(jìn)行過(guò)科學(xué)統(tǒng)計(jì),，連一年色譜柱銷(xiāo)售總量也眾說(shuō)紛云，更別說(shuō)國(guó)內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了,。我估計(jì)是占30%左右吧,。

13.預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問(wèn)題！原來(lái)分析中藥品種時(shí),，我一直都是用保護(hù)柱,。但來(lái)到新公司后，發(fā)現(xiàn)大家都沒(méi)有使用,，幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒(méi)找到一個(gè),，也就是說(shuō)大家從來(lái)都沒(méi)有用過(guò)。后來(lái)問(wèn)一個(gè)老員工,，說(shuō)是有可能影響藥品分析,。我就想問(wèn)：安裝保護(hù)柱后會(huì)影響樣品分析嗎？我們做的大多是頭孢類(lèi)的抗生素,。

答：應(yīng)該這樣說(shuō),，加上保護(hù)柱，肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞,，肯定有害于分離度和柱效,，因?yàn)楸Ｗo(hù)柱中間有著死體積的存在但是如果保護(hù)柱接得好并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換，分離度和柱效應(yīng)該影響并不大,。

頭孢類(lèi)的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,，有些原料藥，可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱（中間是個(gè)篩板）,，制劑的話,，如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動(dòng)相鹽分比較大，那還是最好配個(gè)保護(hù)柱,。

14.用的是四元梯度泵：A：50%甲醇,；B：50%水， 經(jīng)常出現(xiàn)停或進(jìn)氣泡這是什么原因,？

答：水/甲醇比例在55：45時(shí),，黏度和柱壓有個(gè)極大值。50：50接近了這個(gè)極值,，柱壓是比較高的,，但，影響柱壓最大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑,，你這個(gè)實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱,？系統(tǒng)壓力高，可能會(huì)因溶劑泵中的過(guò)濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng),，停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因,，可考慮更換液體通量更大的過(guò)濾頭。

15.填料方法的前三種都是濕法嗎,，能不能對(duì)四種填充方法做一個(gè)簡(jiǎn)短的說(shuō)明,？

答：資料顯示：在正常條件下，填料粒度＞20μm時(shí),，干法填充制備柱較為合適,；顆粒＜20μm時(shí)，濕法填充較為理想,。填充方法一般有4種

①  高壓勻漿法,，多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充；

②  徑向加壓法,，Waters專(zhuān)利,；

③  軸向加壓法，主要用于裝填大直徑柱,；

④干法,。柱填充的技術(shù)性很強(qiáng),，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱,。為什么以20μm為分界點(diǎn)？

16.想請(qǐng)您具體說(shuō)明一下反沖色譜柱的方法,，是不連檢測(cè)器嗎,？

答：反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中。因?yàn)?，有污染物反沖出來(lái),，當(dāng)然不連檢測(cè)器，出液端直接接到廢液瓶就可以,。

17.如果不使用不銹鋼接頭,，而改用peek頭，是否可以完全解決接頭匹配問(wèn)題？

答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的,，供貨商有多個(gè),，VICI，Upchurch,，Parker等,，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái),。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的,，換個(gè)接頭就可以了，而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭,，可以配所有不同類(lèi)型的柱頭,，不泄露，連接死體積又很小,。

18.有的廠商為避免堵塞,，使用了較大孔徑（2～5μm）的前篩板，這種情況反沖會(huì)將填料沖出,。那么,，你們?cè)谑褂谜f(shuō)明書(shū)中會(huì)說(shuō)明前后篩板的孔徑嗎？

答：如果前后篩板孔徑不對(duì)稱(chēng),，廠商肯定也會(huì)在說(shuō)明書(shū)里特別提到的,。

19.我在做多肽藥物時(shí)遇到下列問(wèn)題：

1）基線不穩(wěn)定波動(dòng)大，流動(dòng)相 A ：

1％TF,，A：水溶液,，B：1％TFA乙腈溶液檢測(cè)波長(zhǎng)210nm流速1.0mL/mL 什么原因？怎么解決,？TFA有什么作用,？流動(dòng)相中不加TFA見(jiàn)不到主峰，基線良好,。

2）做完肽類(lèi)樣品時(shí)怎么沖洗C18比較好,；

3）藥典上介紹測(cè)定分子量大于2000的樣品，選擇柱子填料的孔徑為30nm,，30nm與10nm對(duì)結(jié)果有什么區(qū)別,？

答：應(yīng)該是起“離子對(duì)”的作用吧。在做多肽類(lèi)樣品的時(shí)候,，300A孔徑的填料相對(duì)100A孔徑肯定要選擇性好點(diǎn),，也就是分離度相對(duì)比較好點(diǎn)。流動(dòng)相加入TFA,，在反相色譜分離多肽和蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中,，使用三氟乙酸(TFA)作為離子對(duì)試劑是常見(jiàn)的手段,。流動(dòng)相中的三氟乙酸通過(guò)與疏水鍵合相和殘留的極性表面以多種模式相互作用，來(lái)改善峰形,、克服峰展寬和拖尾問(wèn)題,。

※三氟乙酸優(yōu)于其他離子修飾劑的原因是它容易揮發(fā)，可以方便地從制備樣品中除去,。另一方面,，三氟乙酸的紫外最大吸收峰低于200nm ，對(duì)多肽在低波長(zhǎng)處的檢測(cè)干擾很小,。

20.waters,，Atlantis C18柱可以用較高比例的流動(dòng)相，那麼用完后應(yīng)該怎麼清洗,？在什麼體系中保存比教合適,？

答：反相柱都可以用下面通用的方法清洗維護(hù)：
流動(dòng)相中不含緩沖鹽：     
分析完成后，用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min
流動(dòng)相中含有緩沖鹽：      
分析完成后,，先用甲醇（或乙腈）：水＝10：90反向沖洗45min,，然后再用甲醇（或乙腈）：水＝90：10反向沖洗色譜柱45min；（注意：甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易長(zhǎng)菌,，使用時(shí)間不可超過(guò)3天）,；

水性柱保存體系也不特別：

短期保存在所用的流動(dòng)相中（不含緩沖鹽），中長(zhǎng)期保存在純甲醇（乙腈）或80%的甲醇（乙腈）/水中,。

21.正相硅膠柱一般保存在什么溶劑里面比較合適,？

答：短期和長(zhǎng)期都建議保存在正相測(cè)定所用的流動(dòng)相中，一般是正己烷和極少量的異丙醇,。

22.磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng),，為什么，是因?yàn)榕c醋酸鹽,，枸椽酸鹽相比,，基團(tuán)小嗎，使用磷酸鹽緩沖液與其它緩沖液相比,，會(huì)使色譜柱壽命縮短多少,？

答：經(jīng)常用磷酸鹽，在其它條件差不多一樣的情況下,，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些,。但用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧，否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用,。

23.反相離子對(duì)色譜法中，離子對(duì)是如何起作用的,，是離子對(duì)試劑的非極性端溶解在填料的非極性端里,，解離端伸向流動(dòng)相，對(duì)含胺化合起離子交換作用，還是樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物,，離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán),，還是這種結(jié)合物是在解離與結(jié)合的動(dòng)態(tài)平衡之中？

答：首先離子對(duì)試劑的解離端和目標(biāo)離子形成離子締合物,，降低其極性,，這樣就能較好的在柱子上保留。再者,，根據(jù)疏水效應(yīng)理論,，離子對(duì)試劑的疏水端是很容易和C18鏈相互作用的，這樣更容易在柱子上保留,，所以我認(rèn)為離子對(duì)試劑作用是混合保留機(jī)制,，即純粹的反相保留和離子對(duì)保留機(jī)制共同作用。

24.四烷基季銨鹽（如,，四丁基硫酸氫銨,、四丁基溴化銨、四丁基氫氧化銨等）在水中電離后,，也形成了類(lèi)似N＋H(CH2CH3)3的結(jié)構(gòu)N＋(CH2CH2CH2CH3)4,，這種結(jié)構(gòu)也能有效的與Si－O－產(chǎn)生較強(qiáng)的靜電作用，此類(lèi)離子對(duì)用的比較少,，但它的作用僅是掩藏Si－O－嗎,，它對(duì)物質(zhì)的保留性能有何影響，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)檢測(cè)胺化物時(shí),，流動(dòng)相中加入磷酸緩沖鹽有增加物質(zhì)保留的趨勢(shì),，而加入三乙胺則會(huì)降低物質(zhì)的保留能力？

答：前面提到的四丁基氫氧化銨等離子對(duì)試劑確實(shí)不如辛磺酸鈉等極性基是陰離子的離子對(duì)試劑用得普遍,，原因是酸類(lèi)極性物質(zhì)很容易通過(guò)降低pH值的方法提高在反相色譜中的保留能力,，降低pH可抑制酸的電離，使酸處于中性狀態(tài)而與疏水碳鏈的作用力增強(qiáng),。而堿類(lèi)分析物則受硅膠基質(zhì)pH上限的嚴(yán)重影響（以前上限是8,，后來(lái)抬到10，直到最近雜化硅膠才將pH上限提到12左右）,。

銨鹽類(lèi)離子對(duì)試劑確實(shí)有辛磺酸鈉等所不具有的屏蔽硅醇基作用,，但其主要作用還是疏水端和疏水固定相結(jié)合，外露的陽(yáng)離子親水端和酸陰離子作用,，從而提高其保留能力,。當(dāng)然同樣還有第二種解釋機(jī)理，離子對(duì)試劑先和分析物結(jié)合,，掩藏極性基,，從而提高極性分析物在反相色譜中的保留能力,。而且丁基比辛基疏水性差，這種情況下,，認(rèn)為后面的結(jié)合機(jī)理占上風(fēng)的可能性更大,。
檢測(cè)胺類(lèi)化合物，加入三乙胺預(yù)先和硅醇基結(jié)合,，胺和硅醇基作用被三乙胺取代,，保留下降是肯定的。

25.同一根色譜柱在分析完三聚氰胺后,，再分析苯甲酸,、山梨酸、糖精鈉時(shí)為什么保留時(shí)間會(huì)提前,？

答：色譜柱被強(qiáng)保留物質(zhì)污染后,，保留時(shí)間提前和滯后的情況都有，具體要看污染物的性質(zhì),，還要看分析物,、固定相和污染物三者共同作用的情況，情況比較復(fù)雜,，有時(shí)候比較難預(yù)測(cè)是提前還是滯后,。不過(guò)你平時(shí)維護(hù)的時(shí)候，注意在測(cè)定后將污染物用有機(jī)溶劑反沖清洗,，就可以減輕或避免這種情況的出現(xiàn),。建議每個(gè)分析方法用專(zhuān)門(mén)的色譜柱，長(zhǎng)遠(yuǎn)看,，這樣更節(jié)省色譜柱的費(fèi)用,。

26.HPLC柱前衍生和柱后衍生的相關(guān)問(wèn)題？1）為什么要衍生,？2）衍生化的分類(lèi),？3）進(jìn)行衍生，適用的化合物有哪些,？4）進(jìn)行衍生化的要求有哪些,？5）柱前衍生和柱后衍生的優(yōu)缺點(diǎn)？

答：色譜技術(shù)中的化學(xué)衍生法系指在色譜過(guò)程中用特殊的化學(xué)試劑（一般稱(chēng)為衍生化試劑或標(biāo)記試劑）使樣品成分轉(zhuǎn)變相應(yīng)的衍生物之后進(jìn)行分離檢測(cè)或進(jìn)行檢測(cè)的方法,。

目的為：

1.將紫外—可見(jiàn)強(qiáng)吸收功能基團(tuán)引入被檢測(cè)對(duì)象或?qū)⑵滢D(zhuǎn)變?yōu)闊晒庋苌?，以提高檢測(cè)靈敏度；2.提高對(duì)分析樣品的分離和選擇性,。

從是否與HPLC系統(tǒng)聯(lián)機(jī)的角度,，化學(xué)衍生法分為在線online）與離線∣Offline）兩種。從發(fā)生衍生化的場(chǎng)合,，分為柱前衍生法pre-columnderivatization）與柱后衍生法（post-columnderivatization）兩種,。目前,，在HPLC中,，以離線的柱前衍生法（簡(jiǎn)稱(chēng)柱前衍生法）與在線的柱后衍生法（簡(jiǎn)稱(chēng)柱后衍生法）使用居多,。

27.多個(gè)樣品不好不離的時(shí)候，請(qǐng)問(wèn)該怎么通過(guò)選擇合適的柱子來(lái)提高分離度,？

答：提高分離度可從三個(gè)主要影響因素來(lái)考慮,，柱效、選擇性和保留因子,?？赏ㄟ^(guò)減小填料粒徑和增加柱長(zhǎng)提高柱效；選擇性和固定相選擇以及pH條件有關(guān),，通過(guò)選擇合適的色譜柱和合適的pH,，可以提高選擇性；有時(shí)候適當(dāng)延長(zhǎng)出峰時(shí)間增加保留因子,，也可提高分離度,。

28.苯基柱，氰基柱該什么時(shí)候考慮用,？

答：苯基柱用于含苯環(huán)的芳香族化合物的測(cè)定時(shí),，具有較高的選擇性。CN柱可作為一個(gè)保留能力最弱的反相柱使用,，也可作為一個(gè)活性降低的正相柱使用（保留時(shí)間比硅膠柱和氨基柱低很多）,。

29.同樣類(lèi)型柱子還有長(zhǎng)度，粒徑等差異,，這些該怎么去選擇,？

答：長(zhǎng)度和粒徑都是用來(lái)改變柱效的，選擇原則是夠用就好,。

30.我前幾天剛剛裝上一個(gè)新的C18柱,，在進(jìn)樣之前我用100%的甲醇沖了半個(gè)多小時(shí)。剛才看到上面寫(xiě)的要活化什么的,？不知道我只沖洗半小時(shí)就開(kāi)始用對(duì)柱子有沒(méi)有影響,？對(duì)出峰什么的有沒(méi)有影響呢？

答：不是所有的測(cè)定,，都需要對(duì)新柱子用所測(cè)樣品老化,。但先按方法程序進(jìn)樣幾針，觀察到峰面積保留時(shí)間不再有明顯變化,，再開(kāi)始正式測(cè)定,，這是一個(gè)好習(xí)慣。按你現(xiàn)在的做法,，如果第一針和第二針的峰面積,、保留時(shí)間沒(méi)有變化,，就繼續(xù)做沒(méi)影響吧。

31.現(xiàn)在色譜柱和儀器的接口還沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)化嗎,，除了檢測(cè)池的出入管較小外,，色譜柱的接口與peek頭不匹配的有哪個(gè)型號(hào)的色譜柱，以后使用的時(shí)候需要注意一點(diǎn),。同時(shí)發(fā)現(xiàn)使用過(guò)金屬接頭的色譜柱再換成PEEK頭,，常易漏液，這是因?yàn)榻饘兕^易使色譜柱接口變形嗎,？

答：色譜柱接頭其實(shí)大都不是色譜柱廠商自己生產(chǎn)的,，供貨商有多個(gè)，VICI,，Upchurch,，Parker等，他們的標(biāo)準(zhǔn)相互之間不統(tǒng)一,，那色譜柱接頭的標(biāo)準(zhǔn)就統(tǒng)一不起來(lái),。不過(guò)一般這個(gè)問(wèn)題也不難解決的，換個(gè)接頭就可以了,，而且現(xiàn)在有了萬(wàn)用接頭,，可以配所有不同類(lèi)型的柱頭，不泄露,，連接死體積又很小,。

32.普通的C18柱能作為正相色譜柱使用嗎？正相色譜體系中最常用也最普通的是那種色譜柱,。正相柱在使用過(guò)程中與反向柱相比有什么需要注意的地方,？

答：普通C18柱作為正相柱使用，我還沒(méi)聽(tīng)說(shuō)過(guò),。正相色譜分離模式是指固定相的極性比流動(dòng)相的極性大,，反過(guò)來(lái)，流動(dòng)相極性大就是反相,。C18固定相屬于疏水性相對(duì)比較強(qiáng)的,，疏水性強(qiáng)就是極性很弱，應(yīng)該找不出極性比它更弱的流動(dòng)相了,。

正相體系常見(jiàn)的柱子有：硅膠柱,、氨基柱、CN基柱和Diol二醇基柱,，最普通的應(yīng)該就是硅膠柱,。正相柱和反相柱比，最需要注意的是水分，正相柱對(duì)水分非常敏感,，流動(dòng)相中水分含量的些微變化對(duì)保留時(shí)間影響很大,，因此正相柱測(cè)定前平衡時(shí)間需要幾個(gè)小時(shí)甚至更長(zhǎng)。

33.色譜柱的柱頭類(lèi)型與不銹鋼毛細(xì)管接頭有6種連接方式（在講義里面提到）,，那么我們用戶(hù)一般是液相色譜儀是固定某一個(gè)廠家,，而是根據(jù)樣品檢測(cè)需要更換不同類(lèi)型的色譜柱，那么怎么判斷我所購(gòu)買(mǎi)的色譜柱是否與不銹鋼毛細(xì)管是否匹配呢,，我之前只是知道安捷倫和waters都有規(guī)定他們自己家的柱子與自己家的儀器配套是最合適的,，而其他廠家的色譜柱都很少提及,，在不知道的情況下,，我們?cè)撛趺催x擇？月旭的色譜柱柱頭類(lèi)型屬于哪一種類(lèi)型呢,？

答：不銹鋼毛細(xì)管接頭有個(gè)缺點(diǎn),，用過(guò)一次后卡匝位置和距離毛細(xì)管末端的長(zhǎng)度就固定死了。如果下次用的色譜柱的柱頭接口深度和原來(lái)的不同,，就容易產(chǎn)生死體積和泄漏,。產(chǎn)生的死體積一般不大，如果只引起柱效的稍微下降而沒(méi)引起拖尾,，這個(gè)問(wèn)題就容易被忽略,。引起大家關(guān)注的是泄漏，如果用了新柱子,，發(fā)現(xiàn)和毛細(xì)管的接口處有泄漏,，就可以判斷是接頭的匹配問(wèn)題。最好的判斷方法還是：詢(xún)問(wèn)一下廠商色譜柱柱頭的類(lèi)型和柱頭接口的深度,，然后和毛細(xì)管接頭的規(guī)格比較,。

如果用peek接頭，發(fā)生問(wèn)題的情況就大大減少,，因?yàn)?，peek接頭卡匝位置是不固定的。

接頭與色譜柱的匹配,，并沒(méi)有在實(shí)際色譜應(yīng)用中造成很大的問(wèn)題,，有很多人都沒(méi)有關(guān)注到這個(gè)問(wèn)題。一方面原因是使用peek接頭的情況很普遍,，另外,，如果發(fā)現(xiàn)不匹配，換個(gè)毛細(xì)管接頭還是非常方便的,。

34.相對(duì)于氣相色譜,，液相的優(yōu)勢(shì)在哪里？做防腐劑分析時(shí),，流動(dòng)相加入乙酸銨才可以出峰,，原理是什么,？

答：液相和氣相相比的優(yōu)勢(shì)有很多,我認(rèn)為主要在于應(yīng)用范圍更廣。氣相只限于容易氣化的低分子量物質(zhì)的分析測(cè)定,，對(duì)象大部分是基礎(chǔ)化工原材料,；而任何能溶解于某溶劑的物質(zhì)都能用液相分析，適用對(duì)象是分子量從幾十到幾萬(wàn)的廣大范圍,。在制藥,、化工、環(huán)保,、食品和刑偵等諸多重要領(lǐng)域,，液相都已成為主導(dǎo)的分析分離工具,。也有兩者都能應(yīng)用的交叉情況,，但液相的制樣更簡(jiǎn)單。液相色譜的出現(xiàn)克服了氣相色譜不能直接用于難揮發(fā),、熱不穩(wěn)定及高分子化合物的弱點(diǎn),。

35.您提到“磷酸鹽緩沖鹽滲透力強(qiáng),，有加快硅膠溶解的副作用，它的存在會(huì)降低pH使用范圍”,，既然這樣,，經(jīng)常使用，柱子壽命是否也下降的快呀,？

答：經(jīng)常用磷酸鹽,，在其它條件差不多一樣的情況下，柱子壽命肯定比不用磷酸緩沖鹽相對(duì)短一些,，但,，用磷酸鹽也有不可取代的優(yōu)點(diǎn)吧，否則不可能現(xiàn)在大部分人還在用,。

36.CN柱的保存需要在低溫條件,，但是，又不能太低,，使固定相凍結(jié),，怎么控制這個(gè)溫度？怎么判斷固定相是否被凍結(jié),？固定相凍結(jié)后會(huì)是什么樣的現(xiàn)象,？

答：所謂低溫儲(chǔ)存，就是放到陰涼處或者放到冰箱的冷藏室,。儲(chǔ)存液只要不是純水,，冰點(diǎn)都比較低，純甲醇的冰點(diǎn)是零下90度以下了。

37.我們測(cè)試樣品時(shí),，經(jīng)常會(huì)關(guān)心柱壓是否太高,，但是在購(gòu)買(mǎi)色譜柱時(shí)，并沒(méi)有說(shuō)每一根色譜柱的最大使用壓力是多少,？針對(duì)這樣的情況,，用戶(hù)怎么判斷柱壓是否超過(guò)該柱的極限？

答：裝柱時(shí)的壓力比使用時(shí)高很多,，所以柱壓對(duì)色譜柱本身在使用時(shí)沒(méi)有極限問(wèn)題存在,，倒是一般儀器有個(gè)40Mpa的上限。如果色譜分離度還能滿足分析方法要求,，柱壓只要儀器能承受就OK吧,。

38.使用緩沖液不當(dāng)，使硅膠溶解并重新形成粉末后,，會(huì)出現(xiàn)什么樣的異常情況,？怎么處理？

答：出現(xiàn)異常就是柱壓升高,。小粉末在流動(dòng)相不斷沖洗帶動(dòng)下，最后會(huì)聚集在柱子出口端,，沉積在后篩板,。處理方法只有拆下后篩板進(jìn)行清洗或更換，但這樣做會(huì)影響到柱床,，處理后柱效會(huì)下降,。

39.今天才知道濾膜的材質(zhì)分了這么幾種：再生纖維素、聚四氟乙烯,、硝酸纖維和醋酸纖維等,，之前只知道有有機(jī)系和水系之分？各種不同材質(zhì)的濾膜適合于什么樣的樣品,？

答：再生纖維素膜：具有蛋白質(zhì)吸收低,，適用于水溶性樣品和有機(jī)溶劑；

聚四氟乙烯：適用于所有有機(jī)溶劑,，酸和鹽,；

尼龍66：適用于絕大多數(shù)有機(jī)溶劑和水溶液，可用于強(qiáng)酸,，70%的乙醇,，二氯甲烷，不適用與二甲基甲酰胺,；

醋酸纖維：不適用有機(jī)溶劑,，特別適用水基溶液。

40.我原來(lái)遇到個(gè)這樣的問(wèn)題，一直不知道原因,。剛拿柱子做,，色譜條件是成熟的，絕對(duì)沒(méi)問(wèn)題,，但是該條件下保留的物質(zhì)變的不被保留,，比如，本來(lái)保留時(shí)間15分鐘卻怎么調(diào)比例都是2～3分鐘就出峰了,，維護(hù)后,，下次再使用又正常了，什么樣原因??？

答：最大可能是發(fā)生相塌陷了。C18柱和高密鍵合封尾的C8柱,，在高含水流動(dòng)相下會(huì)發(fā)生相塌陷,，后果就是保留能力大幅下降。用有機(jī)相比例較高的流動(dòng)相沖洗后,，又可恢復(fù)正常性能,。

41.UPLC色譜柱可以反沖嗎？HPLC的色譜柱可以簡(jiǎn)單反沖,，但是,，UPLC的色譜柱.也是一樣的嗎？如果壓力偏高,，該怎么辦,？

答：如果兩端篩板孔徑對(duì)稱(chēng)，UPLC柱應(yīng)該也是可以反沖的,。發(fā)現(xiàn)壓力偏高,，當(dāng)然也可以用反沖清洗的方法維護(hù)，UPLC柱和普通色譜柱比,，只是壓力高一點(diǎn),，不應(yīng)該有什么特殊吧。

42.常規(guī)LC的柱子粒度小,，柱效高,，現(xiàn)在有3.5μm的常規(guī)柱，不知道用3.5μm*250的壓力與4.6μm的壓力相差多少,？

答：一般柱子4.6mm×250mm指的是其內(nèi)徑和長(zhǎng)度,。粒徑才用μm的單位，但一般標(biāo)的是5μm,，也有3.5μm的,。其它條件一樣,，光粒徑是3.5μm和5μm的柱壓差別，理論上3.5μm柱子的柱壓是5μm柱子的(5/3.5)平方倍數(shù),，即,，2.04倍，簡(jiǎn)單說(shuō)就是2倍,。

43.因?yàn)?，不知道流?dòng)相已走完，液相色譜柱空走了大概一晚上,，請(qǐng)問(wèn)這種情況下柱子還能用嗎,？如果可以應(yīng)該如何再生？

答：能用的,！可能柱子里會(huì)有氣泡進(jìn)去,，但之后，多用流動(dòng)相沖沖,，看到基線穩(wěn)定,，就沒(méi)問(wèn)題了。用色譜柱的保存液低流速長(zhǎng)時(shí)間沖洗,，然后,，再檢測(cè)一下柱效，看柱子是否恢復(fù),，液相最好設(shè)置一下最低壓限,，這樣就不怕流動(dòng)相走光而會(huì)損傷色譜柱。

44.在梯度洗脫的時(shí)候,，如果整個(gè)時(shí)間程序越長(zhǎng)，保留時(shí)間的重現(xiàn)性越差,，尤其是后出的峰重現(xiàn)性差更明顯,，我猜估計(jì)是流量本身的誤差引起的，但是怎么盡量避免這種情況的出現(xiàn),，使保留時(shí)間重現(xiàn)性更好,？

答：這個(gè)要控制好環(huán)境溫度和柱溫，易揮發(fā)的流動(dòng)相要適當(dāng)密封,，同時(shí),，保留時(shí)間的漂移與儀器的精度也有關(guān)系。

45.我對(duì)聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有興趣,，主要是它耐高溫,、耐酸堿、但有關(guān)這方面的文獻(xiàn)很少,，但對(duì)于他的分離效能我一直心里沒(méi)底,，我的問(wèn)題有三：

1）分離效果與ODS比較,，是相當(dāng)呢，還是更勝一籌,，或是更差,？

2）我原以為它是整體住，但看過(guò)資料后發(fā)現(xiàn)也是顆粒的比如,，5μ,，請(qǐng)問(wèn)該類(lèi)型的柱是否符合速率理論、是不是粒徑越小分離效果會(huì)幾何級(jí)的增加,？

3）問(wèn)什么沒(méi)有1.7μ的這種柱出現(xiàn)呢,？

答：聚合物基質(zhì)色譜柱的優(yōu)點(diǎn)你已經(jīng)提到了，它的缺點(diǎn)有：對(duì)小分子分離的柱效相對(duì)硅膠基質(zhì)色譜柱要低,，表面衍生化修飾也沒(méi)有在硅膠表面豐富,，機(jī)械強(qiáng)度低耐壓性不好，還有碰到某些有機(jī)溶劑會(huì)溶脹等,。,。。

聚合物基質(zhì)柱當(dāng)然也符合速率理論,！它柱效低主要是因?yàn)?，分析物在聚合物固定相中的傳質(zhì)速度比在硅膠表面固定相中慢很多。不過(guò)粒徑越小柱效幾何級(jí)增加的規(guī)律還是有的,。1.7μm的硅膠基質(zhì)填料也是最近幾年才商品化,，1.7μm的聚合物基質(zhì)沒(méi)出來(lái)也正常，或許永遠(yuǎn)都不出來(lái)了,，因?yàn)?，聚合物耐壓差，粒徑做這么小,，它根本承受不了這個(gè)高壓吧,，但愿以后會(huì)有能抗高壓的聚合物填料研究出來(lái)。

46.我之前有了解過(guò)手性色譜柱,，之前買(mǎi)過(guò)大賽璐的手性柱,，其手性柱價(jià)格相比普通反相色譜柱，要高出很多倍,，不知道是本身柱子裝填技術(shù)的難度大還是其他什么原因,？它的主要技術(shù)關(guān)鍵在什么方面？

答：手性柱技術(shù)關(guān)鍵在于手性填料的開(kāi)發(fā),，大賽璐公司在手性填料的生產(chǎn)技術(shù)方面申請(qǐng)了專(zhuān)利保護(hù),，別的廠商不能生產(chǎn)，導(dǎo)致手性柱價(jià)格居高不下,。前幾年傳說(shuō)該公司的專(zhuān)利保護(hù)期限快到了,，國(guó)際國(guó)內(nèi)有些公司就想著仿制生產(chǎn),。后來(lái)又聽(tīng)說(shuō)專(zhuān)利還沒(méi)到期，情況不明,。

47.“樣品與離子對(duì)生成緊密的結(jié)合物,，離子對(duì)試劑掩藏化合物中的極性基團(tuán)”這句話是什么意思？離子對(duì)怎么樣掩蔽化合物中極性基團(tuán),？不就是通過(guò)靜電引力的作用形成離子締合物,，來(lái)降低其極性的嗎？

答：離子對(duì)色譜是解決強(qiáng)極性物質(zhì)在反相色譜中保留能力不足的一個(gè)有效的途徑,。有些堿性極性物質(zhì),，即使用100%水相做流動(dòng)相，且無(wú)論在色譜柱能承受的pH范圍內(nèi)怎么去調(diào)節(jié)pH,，保留能力都不夠,。如果需要分離的組分中全是可以離子態(tài)存在的，那還可以選擇離子交換色譜進(jìn)行分離,。不然的話,，就只有選擇離子對(duì)色譜方法了，盡管它有流傳的那么多副作用存在,。

離子對(duì)試劑含親水基和疏水基,，很像表面活性劑，所以一開(kāi)始離子對(duì)色譜也稱(chēng)為“皂色譜”,。離子對(duì)作用的機(jī)理有兩種解釋?zhuān)闵厦娑家呀?jīng)提到了,。到底是哪種解釋對(duì)，尚無(wú)定論,，實(shí)際上也沒(méi)必要去定論,，反正兩種解釋都通就可以了。主流的解釋也是你先提到的機(jī)理,，下面示意圖更直觀：

我個(gè)人認(rèn)為,，兩種機(jī)理都可能存在，要看離子對(duì)試劑,、固定相和分析物這三者本身情況而定。如果離子對(duì)試劑的疏水端和固定相之間的結(jié)合力相對(duì)更強(qiáng),，示意圖的作用機(jī)理會(huì)占上風(fēng),。反之，離子對(duì)試劑親水端和分析物導(dǎo)致掩藏極性端的作用力更強(qiáng),，你后面提到的機(jī)理更可能,。總之,，要看你用的什么離子對(duì)試劑,，是何種的分析物等具體情況不同而不同吧,。

48.我們?cè)谟玫陌被鶗r(shí)，有時(shí)候峰型突然變寬,，有拖尾,，用一段時(shí)間就又好了，不明白是什么原因造成的,，如果要再生氨基柱的時(shí)候應(yīng)該怎么做呢,？是像您先前回答的問(wèn)題中提到的，用一定比例的氨水沖洗嗎,？氨基柱可以直接用純水沖洗嗎,？記得當(dāng)時(shí)買(mǎi)的氨基柱那個(gè)使用說(shuō)明書(shū)上說(shuō)不能用純水沖？是這樣的嗎,？如果可以沖的話,，一般沖多久？

答：氨基柱的硅膠孔內(nèi)的氨基濃度非常高（大約有1mol/L）,，在有水存在的時(shí)候,，在孔內(nèi)形成一個(gè)pH=10左右甚至超過(guò)10的很強(qiáng)的堿性小環(huán)境，并會(huì)導(dǎo)致硅膠基體慢慢溶解,。不過(guò)硅膠基體的溶解會(huì)生成酸性的硅醇基,，又會(huì)降低孔內(nèi)的pH值，延緩硅膠基體的溶解進(jìn)程,。一段時(shí)間后,，兩個(gè)相反的過(guò)程會(huì)達(dá)成一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡，從而穩(wěn)定下來(lái),。對(duì)你問(wèn)題提到的這個(gè)現(xiàn)象,，我想到的是這個(gè)原因。

氨基柱,，要看氨基柱的應(yīng)用模式,，是正相還是HILIC？這兩種模式的情況是大不相同的,。正相使用,，一般很怕有水，但HILIC模式應(yīng)用,，一般流動(dòng)相是乙腈/水,，是不怕水的。不過(guò),，鍵合氨丙基基團(tuán)非常容易水解,，所以一般氨基柱不適宜保存有水的溶劑中。作為正相應(yīng)用時(shí),，流動(dòng)相中要求一點(diǎn)都不能含水,，但清洗柱子上的污染物質(zhì),，是可以含水的，因?yàn)?，水有?qiáng)極性,，在正相色譜上洗脫能力極強(qiáng)，當(dāng)然不必用100%純水,。氨基柱具體沖洗方法,，正相條件按照正相硅膠柱的清洗方法，HILIC模式按C18柱的清洗方法,。

49.采用國(guó)標(biāo)用C18柱測(cè)定辣椒精辣度,，將辣椒精中添加吐溫系列乳化劑做成水溶辣椒精，請(qǐng)問(wèn)乳化劑對(duì)C18柱是否有影響,？

答：乳化劑和離子對(duì)試劑類(lèi)似,，有極性端和非極性端，肯定會(huì)對(duì)C18柱有影響,。不過(guò),，如果辣椒精是極性物質(zhì)，乳化劑的存在可以提高其在C18柱上的保留能力,。

50.公司按照國(guó)標(biāo)測(cè)定辣椒紅色素中蘇丹紅含量,，標(biāo)品分離很好，峰也不錯(cuò),，但是,，辣椒紅色素由于跟蘇丹紅性質(zhì)很相似，且顏色較深,，分離效果很差,，收得率很低，測(cè)定結(jié)果偏差很大,。該如何處理樣品,？色素是否會(huì)降低柱效？

答：色素不會(huì)降低柱效,，但,，辣椒紅色素主峰濃度過(guò)大，會(huì)影響與臨近雜質(zhì)峰的分離,?？煽紤]稀釋樣品或試試用柱效更高的柱子。