作者：祁慧鹓1，2,，鄭曉璇3,，孫明明3，王金鋒4,，馬迎飛5,，朱 冬6，王風(fēng)賀7,，蔣 新1,，2，葉 茂1,，2（1. 中國科學(xué)院南京土壤研究所,，土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2. 中國科學(xué)院大學(xué),；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院,，土壤生態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室；4. 中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院,；5. 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院,；6. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心；7. 南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院） 來源：土壤學(xué)報(bào)（2021年第58卷第3期） 病毒是地球上數(shù)量最多的生命體,，廣泛存在于地球各種環(huán)境中,。土壤病毒在調(diào)控微生物群落組成、影響元素循環(huán)利用,、促進(jìn)生物進(jìn)化等方面發(fā)揮重要作用,。近年來，海洋環(huán)境中病毒生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展迅速,，雖然學(xué)術(shù)界逐漸意識(shí)到病毒在土壤環(huán)境中發(fā)揮著重要作用,，但由于病毒缺少通用的標(biāo)記基因，以及受到土壤異質(zhì)性,、多樣性的限制,，陸地系統(tǒng)，特別是土壤環(huán)境中病毒研究進(jìn)展相對(duì)緩慢,，土壤病毒學(xué)研究遠(yuǎn)落后于海洋等水體環(huán)境,。噬菌體是寄生在細(xì)菌、古菌等原核生物里的病毒,，也是土壤中最主要的病毒類群,。單株噬菌體的全基因組測(cè)序有助于了解噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)及功能特征；而隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,，宏病毒組學(xué)研究日益受到關(guān)注,，它擺脫了以往微生物分離純培養(yǎng)的限制,，以環(huán)境樣品為研究對(duì)象，直接從土壤樣品中富集和提取病毒基因組后進(jìn)行測(cè)序和生物信息學(xué)分析,，為土壤病毒研究提供了新的技術(shù)手段,。 由此，本文主要介紹了土壤研究方法及病毒組研究進(jìn)展,，指出了土壤病毒研究當(dāng)前面臨的困境,，并對(duì)未來的研究方向和發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了展望，以期為后續(xù)土壤宏病毒研究提供科學(xué)參考,。 1 土壤宏病毒組的研究方法 1.1 土壤病毒核酸提取 大部分土壤病毒被土壤顆粒吸附固定,，對(duì)土壤病毒研究的關(guān)鍵是建立精準(zhǔn)、專性,、高效的提取方法,，獲得吸附于土壤顆粒表面及內(nèi)部的病毒粒子。但土壤環(huán)境復(fù)雜且微生物多樣性高,，在提取病毒宏基因組核酸時(shí)易混入細(xì)菌,、真菌等其他微生物的核酸序列，從而影響后續(xù)基因序列分析,、功能基因注釋的準(zhǔn)確性,。因此，土壤病毒提取方法的選擇（如濾膜,、提取劑等）對(duì)后續(xù)病毒核酸純度,、功能基因注釋的準(zhǔn)確性具有較大影響。G?ller 等分別使用0.22 μm 和0.45 μm 濾膜過濾病毒,，發(fā)現(xiàn)0.22 μm 濾膜可去除更多的細(xì)菌DNA,，且不影響土壤病毒多樣性，而通過0.45 μm 孔徑過濾的病毒體中不僅細(xì)菌污染程度增加,，病毒多樣性也有所下降,。Williamson等比較了10%（w/v）的牛肉膏、250 mmol·L–1甘氨酸溶液,、10 mmol·L–1 焦磷酸鈉和1%（w/v）檸檬酸鉀溶液四種提取劑對(duì)粉砂壤土和砂壤土中病毒的提取效果,。通過活菌計(jì)數(shù)法（也稱間接計(jì)數(shù)法，僅測(cè)活菌總數(shù)）計(jì)算提取率,，發(fā)現(xiàn)250 mmol·L–1 甘氨酸溶液提取率可達(dá)28.9%,；其次是10%（w/v）牛肉膏，提取率為26.0%,；而1%（w/v）檸檬酸鉀溶液和10 mmol·L–1 焦磷酸鈉提取率較低,，分別為16.9%和15.0%。后續(xù)熒光顯微鏡計(jì)數(shù)時(shí),，發(fā)現(xiàn)牛肉膏提取物,、粉砂壤土中焦磷酸鈉提取物和砂壤土中的甘氨酸提取物均無法計(jì)數(shù)類病毒顆粒（virus-likeparticles,，VLPs），故該研究認(rèn)為1%（w/v）檸檬酸鉀溶液是最佳的土壤病毒提取劑,。與此同時(shí),，土壤pH,、土壤陽離子交換量,、溫度、含水量等環(huán)境因子均會(huì)影響土壤病毒粒子的提取效率,。此外,，當(dāng)病毒遺傳物質(zhì)含量較低時(shí)，會(huì)影響后續(xù)宏病毒組分析,，雖可經(jīng)多重置換擴(kuò)增（multiple displacement amplification,，MDA ） 或引物延伸預(yù)擴(kuò)增（ primer extensionpreamplification，PEP）等全基因組擴(kuò)增技術(shù)增加病毒核酸濃度,，但這些技術(shù)在擴(kuò)增產(chǎn)物上可能存在偏好性,。為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，建議提高原始土壤病毒樣品富集量,，再進(jìn)行宏病毒組基因測(cè)序,。 1.2 測(cè)序與病毒序列鑒定 第二代測(cè)序技術(shù)具有通量高、速度快,、成本低的優(yōu)點(diǎn),，使得宏病毒組研究發(fā)生巨大變化。其中Illumina 目前擁有MiSeq,、HiSeq,、NovaSeq 等多個(gè)技術(shù)平臺(tái)，并有多種讀長和通量模式供選擇,。但總體而言,，第二代測(cè)序技術(shù)仍存在序列讀長短的局限性。近年來,，第三代測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展在宏病毒組研究中顯示出巨大潛力,，它無需進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，且具有讀長長的優(yōu)點(diǎn),。隨著第三代測(cè)序技術(shù)的不斷成熟及測(cè)序成本的降低,，預(yù)計(jì)它的普及程度將不斷提升。 在含有病毒和宿主的混合基因組數(shù)據(jù)中,，鑒定病毒序列是解析病毒信息的關(guān)鍵,，會(huì)直接影響后續(xù)病毒功能基因注釋的效果。目前,，識(shí)別完整微生物基因組中原噬菌體的工具主要有Phage_Finder,，Prophinder[17]和PHAST,。PHAST 速度快、準(zhǔn)確性高的優(yōu)勢(shì)使其成為極具吸引力的工具,，后續(xù)由于序列數(shù)據(jù)庫規(guī)模的擴(kuò)大及用戶數(shù)量的增加,，PHAST 發(fā)行了新版本PHASTER。與PHAST 相比,，新版本的突出優(yōu)勢(shì)在于可以識(shí)別宏基因組拼接產(chǎn)物的原噬菌體,。盡管PHASTER 與PHAST 是在細(xì)菌基因組中鑒別原噬菌體的兩個(gè)廣泛使用的工具，但值得注意的是,，對(duì)預(yù)測(cè)的原噬菌體精準(zhǔn)程度,，如融合位點(diǎn)的位置仍存在一些不確定性。此外,，這些軟件大多沒有設(shè)計(jì)專門的算法用于相對(duì)較短的重疊群或支架,，且無法在短時(shí)間內(nèi)同時(shí)處理大量的序列，因此并不適合從宏基因組數(shù)據(jù)中鑒別病毒序列,。2015年Roux 等開發(fā)了一款工具—VirSorter,，不僅可識(shí)別完整微生物基因組中的原噬菌體，還可用于檢測(cè)拼接宏基因組數(shù)據(jù)中的病毒序列,。VirSorter 雖然在很大程度上依賴于對(duì)已有病毒基因組的相似性搜索,，但它卻使用了一個(gè)自定義的病毒參考基因組數(shù)據(jù)庫，增加了從淡水,、海水,、人體腸道、肺和唾液中取樣的宏病毒組序列,。2017 年Ren 等開發(fā)了一款基于k-mer 的工具VirFinder,，用于從宏基因組數(shù)據(jù)中識(shí)別原核病毒序列。與基于基因的病毒分類工具VirSorter 相比,，VirFinder 在識(shí)別病毒序列方面明顯優(yōu)于VirSorter,。在模擬數(shù)據(jù)集中，VirFinder 從1,、3 和5 kb 序列中識(shí)別病毒序列的真陽性率分別較VirSorter 高78 倍,、2.4 倍和1.8 倍；其假陽性率與VirSorter 相同,，表明VirFinder 真陽性更高,、對(duì)短片段序列的識(shí)別效果更好。但這兩款軟件也有其局限性,，VirSorter 和VirFinder 為檢測(cè)細(xì)菌和古細(xì)菌病毒而優(yōu)化設(shè)計(jì),，不能很好地檢測(cè)真核病毒；且兩者在微生物群落中對(duì)病毒分析的功能相對(duì)有限,，在鑒定出病毒序列后,，沒有進(jìn)一步分析病毒與宿主的對(duì)應(yīng)關(guān)系,。相比之下，VirMiner 是一款病毒預(yù)測(cè)與分析宏病毒組樣本的綜合工具,，能夠捕獲到高豐度的噬菌體序列,，這些噬菌體在感染細(xì)菌和影響微生物群落動(dòng)態(tài)方面起著關(guān)鍵作用；更重要的是,，VirMiner 提供了更全面的噬菌體分析流程,，包括宏基因組原始讀段處理、功能注釋,、噬菌體序列鑒定,、噬菌體-宿主侵染關(guān)系預(yù)測(cè),；此外,，當(dāng)宏基因組序列包括不同條件的數(shù)據(jù)（如處理組和對(duì)照組）時(shí)，還可支持不同組之間的統(tǒng)計(jì)比較,。 1.3 病毒功能基因注釋 病毒功能基因注釋是將預(yù)測(cè)出的編碼基因通過與相關(guān)數(shù)據(jù)庫的參考序列進(jìn)行比對(duì),，在與現(xiàn)有病毒進(jìn)行同源性搜索的基礎(chǔ)上，獲取該基因的功能信息,。通過對(duì)病毒功能基因注釋,，不僅為深入認(rèn)識(shí)病毒個(gè)體生命過程提供理論基礎(chǔ)；還有助于了解病毒群落的生態(tài)過程及與宿主群落的生態(tài)互作關(guān)系,，從而闡釋病毒與宿主,、環(huán)境間復(fù)雜的相互作用機(jī)制。本文重點(diǎn)從單個(gè)噬菌體的全基因組測(cè)序及土壤宏病毒組兩方面闡釋了土壤病毒的功能基因注釋,。 單個(gè)土壤噬菌體的全基因組注釋流程,，首先從土壤篩選分離得到噬菌體，經(jīng)純化,、濃縮后采用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征,；隨后提取噬菌體核酸，進(jìn)行全基因組測(cè)序,，在過濾掉低質(zhì)量序列后進(jìn)行全基因組序列組裝,，并通過注釋軟件等在線工具，對(duì)噬菌體全基因組序列進(jìn)行功能注釋,。 土壤宏病毒組的功能基因注釋由土壤樣品制備與宏病毒組分析兩個(gè)主要部分組成（圖1）,，具體步驟包括：（1）根據(jù)研究目的從相應(yīng)的土壤中采集樣本，并根據(jù)病毒類型,、土壤理化性質(zhì)等選擇合適的緩沖液進(jìn)行土壤病毒提取,，隨后對(duì)提取液進(jìn)行過濾，去除細(xì)菌等其他潛在宿主,，進(jìn)而濃縮富集,、純化病毒,；（2）通過病毒核酸提取試劑盒或手工提取的方式獲取病毒核酸、構(gòu)建測(cè)序文庫,、并通過測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行宏病毒組測(cè)序,；（3）對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，基于重疊區(qū)（overlap）將高質(zhì)量測(cè)序讀段（reads）拼接為重疊群（contigs）,，進(jìn)一步組裝成支架（scaffolds）,；（4）通過病毒序列識(shí)別軟件在重疊群或支架中判別、篩選出病毒序列,；（5）使用基因預(yù)測(cè)軟件對(duì)病毒基因組ORF 進(jìn)行預(yù)測(cè),，再通過注釋工具將ORF 與多個(gè)數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行功能基因注釋；（6）自動(dòng)注釋后,，為保證結(jié)果準(zhǔn)確性,，可手動(dòng)修正自動(dòng)注釋結(jié)果并進(jìn)行適當(dāng)補(bǔ)充。 圖1 病毒功能基因注釋流程圖 Fig. 1 Flowcharts of functional gene annotation for virus 目前,，普遍采用與各種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)的方法,，對(duì)樣本中的基因功能進(jìn)行注釋分析。在注釋過程中,，研究人員通常根據(jù)自身需求選擇合適的功能數(shù)據(jù)庫,。其中Pfam 數(shù)據(jù)庫是一個(gè)基于多序列比對(duì)和隱馬爾可夫模型的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和家族數(shù)據(jù)庫，可提供蛋白質(zhì)家族和結(jié)構(gòu)域的完整準(zhǔn)確分類,，被廣泛用于查詢蛋白家族或蛋白結(jié)構(gòu)域的注釋,，結(jié)構(gòu)及多序列比對(duì)信息，在基因功能注釋上可用性較強(qiáng)[23-24],。它有A 和B 兩個(gè)質(zhì)量級(jí)別的家族數(shù)據(jù)庫,，Pfam A 通過比對(duì)人工校正過的種子序列，并使用隱馬爾可夫模型進(jìn)行選擇,，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高,；Pfam B 為算法自動(dòng)生成，雖可靠性降低,，但也可以被用于鑒別功能保守的區(qū)域,。GO（gene ontology）數(shù)據(jù)庫分別從細(xì)胞學(xué)組件、分子功能,、生物學(xué)途徑對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行簡單注釋,。經(jīng)GO 數(shù)據(jù)庫注釋后，可得到基因在不同類別中注釋的具體情況,。而KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）是一個(gè)系統(tǒng)分析基因功能的知識(shí)庫,，核心為KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫。利用KEGG 進(jìn)行注釋后，能清楚地反映出基因與相關(guān)代謝的關(guān)系[25] ,。COG （ clusters oforthologous groups）數(shù)據(jù)庫是由NCBI 創(chuàng)建并維護(hù)的蛋白數(shù)據(jù)庫,。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，COG 陸續(xù)在不同物種中建立相關(guān)的同源蛋白簇,?；谕暾删w基因組中的編碼蛋白系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，構(gòu)建而成的POG（phage orthologous groups）數(shù)據(jù)庫便是其中的一個(gè)分支,。通過比對(duì),，可將某個(gè)特定蛋白序列注釋到一個(gè)由直系同源序列構(gòu)成的POG 中，從而推測(cè)該序列的功能,。此外,，POG 數(shù)據(jù)庫包含了進(jìn)化過程中基因得失信息，還可用于系統(tǒng)發(fā)育的統(tǒng)計(jì)推斷和祖先基因組的重建,。CAZy（carbohydrate-activeenzyme）數(shù)據(jù)庫則針對(duì)性較強(qiáng),，是一類與合成或分解復(fù)雜碳水化合物和糖復(fù)合物酶類有關(guān)的數(shù)據(jù)庫，可提供碳水化合物酶類物種來源,、酶功能分類,、基因序列,、蛋白質(zhì)序列及其結(jié)構(gòu)等信息,。還有一些小眾數(shù)據(jù)庫，如抗性基因數(shù)據(jù)庫CARD（comprehensiveantibiotic resistance database）在細(xì)菌耐藥性的分子基礎(chǔ)上,，提供了參考DNA 和蛋白質(zhì)序列,、檢測(cè)模型和生物信息學(xué)工具[29]。ARO（antibiotic resistanceontology）是該數(shù)據(jù)庫的核心,，包含了與抗生素抗性基因,、抗性機(jī)制、抗生素相關(guān)的條目,。通過與該數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),，可得到與耐藥基因相關(guān)的注釋信息。 2 土壤噬菌體基因組研究進(jìn)展 噬菌體是土壤中最主要的病毒類群,，對(duì)單個(gè)噬菌體進(jìn)行全基因組測(cè)序和功能基因注釋,，有助于探明該噬菌體的基因信息和功能特征，進(jìn)而挖掘該噬菌體在環(huán)境修復(fù),、疾病治療等實(shí)際應(yīng)用中的巨大潛力,。如近年來，噬菌體療法作為一種可以高效靶向追蹤滅活土壤體系中致病細(xì)菌的有效手段而日益受到關(guān)注,，故分離篩選出新型烈性噬菌體菌株資源對(duì)于噬菌體療法具有重要意義,。但由于一些噬菌體攜帶毒力基因等原因，導(dǎo)致噬菌體防治存在“雙刃劍”風(fēng)險(xiǎn)。因此,，從土壤中分離單株噬菌體,，并對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序、功能基因注釋有助于我們更好的了解噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)及功能特征,。 2.1 全基因組測(cè)序下的土壤噬菌體研究趨勢(shì) 借助Web of Science 核心合集以“completegenome sequence”和“phage”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索,，在2000 年-2020 年時(shí)間段內(nèi)共有1 508 篇相關(guān)文獻(xiàn)。發(fā)現(xiàn)近20 年該領(lǐng)域發(fā)文量呈現(xiàn)整體上升趨勢(shì)（圖2a）,。隨后利用VOSviewer[32]可視化分析軟件對(duì)關(guān)鍵詞進(jìn)行聚類分析（圖2b）,。圖中節(jié)點(diǎn)大小表示關(guān)鍵詞出現(xiàn)的頻率，顏色反映不同時(shí)間的研究熱點(diǎn),，其中黃色部分代表了較為前沿的關(guān)鍵詞,。總體而言,，“開放閱讀框open reading frame”,、“原噬菌體prophage”、“病原體pathogen”,、“表征 characterization”,、“作用role”是出現(xiàn)頻率較高的詞，表明對(duì)噬菌體的研究主要聚焦于其形態(tài)和功能,。值得注意的是,，“土壤soil”、“抗生素抗性antibiotic resistance”,、“噬菌體療法phage therapy”是近幾年出現(xiàn)的關(guān)鍵詞,。“土壤soil”的出現(xiàn)表明土壤噬菌體領(lǐng)域的研究將日益受到重視,；此外,，由于近年來土壤中抗生素抗性基因的增多、超級(jí)細(xì)菌的出現(xiàn),，噬菌體療法可能成為未來土壤中病原細(xì)菌滅活的重要手段,。因此，研發(fā)對(duì)病原細(xì)菌具有廣譜性的混合噬菌體雞尾酒制劑,，探明噬菌體療法對(duì)于土壤微生物群落結(jié)構(gòu),、功能及養(yǎng)分循環(huán)的影響可能是未來土壤噬菌體領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。 2.2 全基因組測(cè)序下的土壤噬菌體研究進(jìn)展 蘇靖芳等人[31]以引起煙草以及多種茄科植物產(chǎn)生萎蔫癥的青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）為宿主,，采用雙層平板法從煙田土壤中分離出一株烈性噬菌體RS-PII-1,。隨后對(duì)噬菌體RS-PII-1 進(jìn)行全基因組測(cè)序，并通過RAST 在線軟件對(duì)噬菌體全基因組序列進(jìn)行功能注釋,，發(fā)現(xiàn)該基因組含有46 個(gè)ORF,，其中25 個(gè)ORF 可被注釋為相應(yīng)的功能蛋白,、結(jié)構(gòu)蛋白，但仍存在21 個(gè)功能未知的ORF 假想蛋白（hypothetical protein）,。通過與已知噬菌體全基因組序列比較分析以及噬菌體RS-PII-1 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建,，發(fā)現(xiàn)噬菌體RSJ2、RSB1 與RS-PII-1 相似度最高,，但噬菌體RS-PII-1 基因組中功能蛋白和假想蛋白區(qū)域與兩株噬菌體仍存在明顯差異,， 表明RS-PII-1 是一株全新的青枯雷爾氏菌烈性噬菌體，這對(duì)防控由青枯雷爾氏菌引起的細(xì)菌性病害具有較強(qiáng)的應(yīng)用意義,。蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）可導(dǎo)致人體腹瀉,、嘔吐等食源性中毒，Hock 等[33]從土壤中分離出一株感染蠟狀芽孢桿菌的長尾病毒科噬菌體DeepPurple,，隨后對(duì)該噬菌體進(jìn)行全基因組測(cè)序,、預(yù)測(cè)潛在編碼序列（coding sequence，CDS）,，并對(duì)CDS 進(jìn)行功能注釋,。結(jié)果表明，CDS 可分為結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白（structural related proteins）,、DNA 復(fù)制轉(zhuǎn)錄（DNA replication and transcription）,、DNA 包裝（DNA packaging）及宿主裂解（host lysis）四個(gè)功能組。同時(shí)發(fā)現(xiàn),，該噬菌體不存在編碼潛在毒力因子的基因,，且具有熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性的特點(diǎn),，研究人員認(rèn)為噬菌體DeepPurple 可作為治療由蠟狀芽孢桿菌引起的食物中毒的潛在藥物,。綜上所述，全基因組測(cè)序下的土壤噬菌體研究不僅有助于了解土壤中新型噬菌體的結(jié)構(gòu)和功能,，在致病菌引起的細(xì)菌性病害治療方面也具有積極意義。 圖2 噬菌體全基因組測(cè)序領(lǐng)域年發(fā)表論文數(shù)量（a）及關(guān)鍵詞（b）共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖譜 Fig. 2 Number of publications（a）and keyword（b）co-occurrence network map in the field of phage genome sequencing 3 土壤宏病毒基因組研究進(jìn)展 3.1 土壤環(huán)境中的宏病毒組研究 宏病毒組主要對(duì)種群結(jié)構(gòu),、基因功能活性,、病毒與宿主的協(xié)作關(guān)系以及與環(huán)境之間的聯(lián)系進(jìn)行探究，這為土壤環(huán)境微生物群落的研究提供了有力支撐[9,，34],。病毒識(shí)別及其功能基因注釋是其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)，在完成數(shù)據(jù)質(zhì)控,、基因組裝,、基因預(yù)測(cè)等過程后，將預(yù)測(cè)的病毒編碼基因與COG,、eggNOG等數(shù)據(jù)庫比對(duì),，獲得病毒功能信息。表1 對(duì)近年來土壤病毒組研究中具有代表性的功能基因進(jìn)行總結(jié)，以揭示病毒與宿主群落的相互作用機(jī)制及其在元素生物地球化學(xué)循環(huán)中的作用機(jī)理,。Jin 等[36]在中國廣西和海南三個(gè)紅樹林生境采集樣本,，研究了紅樹林土壤病毒功能多樣性。通過將預(yù)測(cè)的病毒ORF 與eggNOG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)ORF 無法獲得注釋信息,，但有138 個(gè)ORF可以注釋到與碳水化合物活性酶（carbohydrate-activeenzyme，CAZyme）相關(guān)的基因,。隨后,，經(jīng)過CAZy數(shù)據(jù)庫的進(jìn)一步注釋，顯示糖苷水解酶類（glycosidehydrolases）ORF 最為豐富,，其次是糖基轉(zhuǎn)移酶類（ glycosyl transferases）,、碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding modules）等。這表明病毒可通過復(fù)雜多糖的生物分解直接調(diào)控碳循環(huán),，揭示了病毒在有機(jī)碳分解中的重要作用,。Bi 等在中國西南部地區(qū)采集了4 個(gè)玉米根際土壤及4 個(gè)非根際土壤樣本，探究農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中病毒的多樣性及其對(duì)潛在生物地球化學(xué)循環(huán)的影響機(jī)制,。通過對(duì)土壤病毒組進(jìn)行測(cè)序,，將測(cè)序讀段組裝成237 個(gè)長度為10kb 以上的重疊群，并通過VirSorter 軟件鑒定病毒序列,。對(duì)這些土壤病毒進(jìn)行功能基因注釋,，共有40個(gè)基因被鑒定為溶菌酶或幾丁質(zhì)酶，可用于降解宿主細(xì)胞壁,。此外,，共鑒定出了48 個(gè)ORF 與碳水化合物活性酶相關(guān)，包括碳水化合物結(jié)合模塊,、碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases）及糖苷水解酶,。表明病毒可能編碼改變宿主活性的輔助代謝基因，間接參與土壤碳元素的生物地球化學(xué)循環(huán),。值得注意的是,， 研究人員發(fā)現(xiàn)該農(nóng)業(yè)土壤中病毒的大多數(shù)CAZyme 基因與紅樹林土壤中的病毒并不同，認(rèn)為病毒編碼的酶可能具有環(huán)境特異性,。Segobola 等通過宏病毒組技術(shù)對(duì)灌木土壤的病毒群落進(jìn)行探究,。經(jīng)過病毒基因組測(cè)序、組裝及功能基因注釋,，發(fā)現(xiàn)組裝后最長的重疊群近乎一個(gè)完整的噬菌體基因組,。該基因組的基因15 和基因16 分別對(duì)應(yīng)末端酶大亞基和小亞基基因，參與了噬菌體雙鏈DNA的裂解和包裝,；基因34 的翻譯產(chǎn)物被識(shí)別為假定的ERF 超家族蛋白,，可參與噬菌體基因組的重組,；基因41 的翻譯產(chǎn)物被鑒定為gp77 蛋白，與分枝桿菌（Mycobacterium）噬菌體Che9d 編碼的同源物有95%的相似性,，該蛋白在噬菌體復(fù)制的早期起到關(guān)閉基因（shut-off genes）的作用,。通過KEGG Orthology（KO）數(shù)據(jù)庫對(duì)宏病毒組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)相關(guān)代謝蛋白（如碳水化合物代謝,、氨基酸代謝和核苷酸代謝）識(shí)別率最高,，表明土壤病毒很可能干擾宿主的新陳代謝。Liang 等從美國東南部農(nóng)業(yè)區(qū)老成土（美國土壤分類系統(tǒng)的一個(gè)土綱）中提取病毒,。通過對(duì)土壤表層（0～16 cm）和亞表層（55～92 cm）病毒組基因序列進(jìn)行組裝,、分類，隨后采用VIROME對(duì)ORF 進(jìn)行功能基因注釋,，發(fā)現(xiàn)大量病毒組序列功能未知,，50.3%的預(yù)測(cè)蛋白在所比對(duì)的數(shù)據(jù)庫中沒有顯著同源性；有35.4%～38.7%的ORF 被注釋為與宿主代謝途徑相關(guān),，如細(xì)胞信號(hào)（cell signaling）,、氧化磷酸化（oxidative phosphorylation）、遺傳信息處理（genetic information processing）和磷,、蛋白質(zhì)及碳水化合物的代謝（metabolisms of phosphorous,，protein，and carbohydrates）等,。此外,，研究人員還在病毒組中發(fā)現(xiàn)了豐富的碳水化合物代謝（carbohydratemetabolism）基因，表明病毒可能參與土壤碳循環(huán)的調(diào)節(jié),。值得注意的是,，在亞表層土壤病毒組中檢測(cè)到的功能蛋白（除參與氧化磷酸化的蛋白質(zhì)）編碼基因豐度比表層土壤病毒體高16 倍，表明亞表層土壤病毒雖密度較低,，但可能與微生物介導(dǎo)的過程密切相關(guān),；與噬菌體感染循環(huán)（即噬菌體溶源、裂解循環(huán)和原噬菌體誘導(dǎo)）和噬菌體結(jié)構(gòu)成分（如噬菌體衣殼） 相關(guān)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)化豐度（ normalizedabundances）在亞表層土壤病毒組中也更高,，這可能與病毒宿主在貧瘠營養(yǎng)條件下的協(xié)同進(jìn)化有關(guān),。由此可得，病毒在調(diào)控土壤中營養(yǎng)元素生物地球化學(xué)循環(huán),，調(diào)節(jié)宿主新陳代謝及微生物群落結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用。
3.2 特殊及極端陸地環(huán)境中宏病毒組研究 Gao 等于廣東某鉛鋅礦尾礦庫采集樣本,，研究高度分層硫化尾礦中病毒群落組成和功能特征,。通過將預(yù)測(cè)的病毒蛋白與eggNOG 數(shù)據(jù)庫比對(duì)，進(jìn)行了病毒基因組直系同源基因簇COG 的注釋分析,。發(fā)現(xiàn)地表尾礦由于存在大量古菌和古菌病毒,，導(dǎo)致大多數(shù)COG 注釋困難,；反之，以細(xì)菌為主的深層病毒群落存在著大量與同化硫酸鹽還原,、轉(zhuǎn)座酶,、DNA復(fù)制、噬菌體整合酶和重組酶相關(guān)的COG,。隨后研究者試圖確定病毒編碼的輔助代謝基因,，發(fā)現(xiàn)深層病毒群落含有豐富的同化硫酸鹽還原輔助代謝基因，這有利于宿主利用硫酸鹽,，進(jìn)而促進(jìn)病毒的復(fù)制和繁殖,。Daly 等對(duì)水力壓裂井中病毒與宿主的相互作用動(dòng)力學(xué)進(jìn)行探究， 施加應(yīng)激源對(duì)菌株（Halanaerobium. congolense WG8）進(jìn)行原噬菌體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),，并對(duì)病毒核酸進(jìn)行純化,、測(cè)序、基因注釋,。結(jié)果顯示,，病毒基因組中存在與整合酶（integrase）、切除酶（ excisionase ）,、假想蛋白以及轉(zhuǎn)座酶（transposase）相關(guān)的基因,；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，其中一個(gè)基因被注釋為重疊感染排斥蛋白（ superinfectionexclusion protein）基因,，推測(cè)該基因的存在可能有助于維持宿主容納原噬菌體與細(xì)胞裂解的平衡,。Bezuidt 等在南極土壤群落中使用VirSorter 工具從宏基因組序列數(shù)據(jù)中組裝了793 個(gè)重疊群。通過病毒基因組數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行分類注釋,，有645 個(gè)contigs 被定義為病毒,，且560 個(gè)被進(jìn)一步劃分為有尾噬菌體目。隨后使用eggNOG 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分析,，發(fā)現(xiàn)噬菌體具有促進(jìn)宿主感染的基因,，如編碼幾丁質(zhì)酶的基因，可參與宿主生物膜的降解,。此外,，eggNOG 功能分析也揭示了增強(qiáng)噬菌體毒性基因的存在，其中編碼甲基轉(zhuǎn)移酶的基因最為豐富,，該基因編碼的酶有利于噬菌體規(guī)避宿主的限制修飾（restriction-modification,，RM）系統(tǒng)。這一結(jié)果表明,，噬菌體可能在面臨進(jìn)化壓力時(shí)發(fā)展出對(duì)宿主的規(guī)避機(jī)制,。Adriaenssens 等[43]對(duì)納米比亞沙漠巖石下生物宏病毒組進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)病毒為有尾噬菌體目,，其中長尾病毒科是最常見的病毒型,。通過功能基因注釋,，有3%的基因被MG-RAST 分類為“毒力、疾病,、防御”（virulence,，disease and defense）子系統(tǒng)，相應(yīng)的編碼序列被鑒定為來自致病細(xì)菌的假想蛋白或噬菌體相關(guān)蛋白,，如整合酶和復(fù)制蛋白（replication proteins）,。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)噬菌體中存在與磷酸鹽調(diào)節(jié)相關(guān)的輔助代謝基因phoH,，并通過MetaVir 鑒定出18 條完整的phoH 基因和23條部分phoH 序列,。而在用極大或然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹卻顯示大部分沙漠巖石下病毒phoH 氨基酸序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫中的完整噬菌體基因組序列關(guān)系較遠(yuǎn)，且海洋和沙漠巖石下病毒phoH 基因分布在不同的進(jìn)化枝上,，表明納米比亞沙漠巖石中存在獨(dú)特的噬菌體phoH 基因序列,。值得注意的是，該病毒樣本中沒有發(fā)現(xiàn)與光合作用或營養(yǎng)脅迫相關(guān)的宿主衍生基因,，推測(cè)此生境中phoH 基因較其他輔助代謝基因發(fā)揮更重要的作用,。Emerson 等在瑞典斯托達(dá)倫沼澤地的泥炭巖芯處，采集了三個(gè)不同棲息地的病毒樣本,，從中獲得了53 個(gè)vOTUs（viraloperational taxonomic units）,，發(fā)現(xiàn)僅有約30%的基因可被注釋，該結(jié)果可以佐證土壤是大量未知病毒遺傳多樣性的儲(chǔ)存庫,。此外,，在13 個(gè)vOTUs 中鑒定出多個(gè)參與多糖結(jié)合（polysaccharide binding）、多糖降解（polysaccharide degradation）,、中心碳代謝（central C metabolism）及孢子形成（sporulation）的輔助代謝基因,。病毒的中心碳代謝基因可能在感染宿主期間增加核苷酸和能量產(chǎn)生；調(diào)節(jié)內(nèi)孢子形成過程中的兩個(gè)輔助代謝基因spoVS 和 whiB 分別有助于形成隔膜和外套,，從而提高孢子的耐熱性,。這揭示了病毒在介導(dǎo)碳代謝、土壤有機(jī)質(zhì)降解,、多糖結(jié)合和孢子形成過程中的調(diào)控作用,。 上述案例揭示病毒不僅在農(nóng)業(yè)土壤中與宿主、環(huán)境之間存在復(fù)雜的相互作用聯(lián)系,，而且在極端,、特殊的陸地環(huán)境中對(duì)調(diào)控微生物群落組成、影響生物地球化學(xué)循環(huán),、促進(jìn)生物協(xié)同進(jìn)化等方面也具有巨大潛能,。 4 土壤宏病毒基因組的前沿與展望 現(xiàn)階段學(xué)術(shù)界對(duì)土壤病毒及其功能基因的科學(xué)認(rèn)知依然十分有限?；诓《窘M學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì),，今后土壤病毒組研究方向主要聚焦在以下方面： 1）土壤病毒主要通過微孔濾膜過濾的方式進(jìn)行富集，該方法易將較大的病毒類型（如最近發(fā)現(xiàn)的巨型噬菌體）屏蔽在外[46-47],，從而缺乏對(duì)此類病毒功能基因的認(rèn)識(shí),；此外，目前的研究主要聚焦于DNA 病毒,，對(duì)RNA 病毒研究較少,。未來需研發(fā)針對(duì)巨型病毒的提取和富集技術(shù)、關(guān)注土壤RNA 病毒的基因功能,，這有助于學(xué)者探明土壤整體病毒的生態(tài)功能及作用機(jī)制,。 2）現(xiàn)階段土壤病毒的提取、宏病毒組分析等缺乏統(tǒng)一技術(shù)規(guī)范,。開發(fā)宏病毒組研究獨(dú)有的新方法,，逐步規(guī)范技術(shù)流程，制定可以廣泛通用于土壤宏病毒組分析的技術(shù)導(dǎo)則和標(biāo)準(zhǔn)十分必要,。 3）目前病毒功能基因注釋較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力,，即使通過自動(dòng)注釋也因其準(zhǔn)確性不足，需后期人工注釋進(jìn)行修正,，因此未來需開發(fā)更加高效,、準(zhǔn)確的生物信息學(xué)工具，識(shí)別病毒并注釋其基因組中的基因功能,。 4）土壤病毒學(xué)的研究還處于起步階段,，病毒基因組測(cè)序的數(shù)量遠(yuǎn)落后于相應(yīng)宿主細(xì)菌的基因組測(cè)序數(shù)量，通過同源蛋白對(duì)土壤病毒基因組上的蛋白功能進(jìn)行注釋時(shí),，由于病毒ORF 更短,、進(jìn)化更快，以及全球病毒取樣的有限性,、數(shù)據(jù)庫較小等原因,，導(dǎo)致部分ORF 找不到匹配的功能注釋。故仍需大力發(fā)展全基因組擴(kuò)增技術(shù)和測(cè)序技術(shù),，不斷完善土壤病毒資源庫,，為病毒功能基因注釋提供有力支撐。 5）關(guān)注土壤病毒群落與宿主菌群的生態(tài)關(guān)系,，進(jìn)一步探究土壤病毒群落在元素生物地球化學(xué)循環(huán)中的直接與間接調(diào)控作用,，深入探明土壤病毒與污染物的響應(yīng)機(jī)制。 致 謝 衷心感謝美國Rice 大學(xué)土木與環(huán)境工程系俞萍鋒博士在本文撰寫和修改過程中給予的學(xué)術(shù)指導(dǎo)和建議,。 參考文獻(xiàn)略,。 |
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