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北京工業(yè)大學(xué)氫分子生物醫(yī)學(xué)團隊 有沒有想過我們司空見慣的綠豆芽和氫氣的關(guān)系？有沒有想過在發(fā)豆芽過程中會產(chǎn)生大量的氫氣,？這些氫氣是哪里來的,？現(xiàn)在就從綠豆芽入手來看看氫氣和線粒體的關(guān)系。 
一,、線粒體和葉綠體 動物細(xì)胞和植物細(xì)胞都是真核細(xì)胞,，它們共同的特點是都有細(xì)胞核和細(xì)胞器。有兩個細(xì)胞器與能量代謝密切相關(guān),，即線粒體和葉綠體,，線粒體是所有真核細(xì)胞都有的，而葉綠體則是植物細(xì)胞特有的,。線粒體是細(xì)胞的能量工廠,，可以通過氧化磷酸化產(chǎn)生細(xì)胞需要的能量；葉綠體是光合作用的場所,，可以把光能轉(zhuǎn)化成化學(xué)能,。線粒體和葉綠體的共同特點是在它們的膜上有電子傳遞鏈，通過電子和質(zhì)子的分離以及電子的流動形成質(zhì)子在膜兩側(cè)的濃度差,，由此形成的電位差推動能量貨幣ATP的合成,。 
線粒體和葉綠體的能量轉(zhuǎn)換,。（a）線粒體中，在氧的高還原電位和線粒體中各種底物（燃料）的相對低還原電位的驅(qū)動下,，電子自發(fā)地通過膜結(jié)合載體鏈移動傳遞給氧氣（呼吸鏈）,。（b）葉綠體中，水光解產(chǎn)生氧氣和電子,，由葉綠素吸收的光子能量驅(qū)動電子通過膜結(jié)合載體鏈的運動,。在這兩種細(xì)胞器中，在電子流動的同時,，帶正電荷的質(zhì)子（H+)的跨膜運動產(chǎn)生電電位差,，通過膜結(jié)合的ATP合成酶驅(qū)動ATP的合成。
看到這里是不是有種似曾相識的感覺：氫化酶催化的反應(yīng)（ H2 ? 2H++ 2e-）聯(lián)結(jié)了氫氣（H2）,、質(zhì)子（H+）和電子（e）這三個在生命能量代謝中的核心,。如果細(xì)胞的線粒體有氫化酶的功能能夠直接把氫氣變成質(zhì)子和電子那就有意思了。這個想法第一次想到是在2015年冬天,，從此一直念念不忘想要證明,。 從前邊幾篇的介紹我們已經(jīng)熟悉,，許多微生物可以通過氫化酶產(chǎn)生或分解氫氣,，也就是具有氫氣代謝的能力。早在1896年Jackson等就發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻Anabaena具有放氫現(xiàn)象（Jacson, 1896）,，藍(lán)藻是含葉綠素a,，但不含葉綠體（區(qū)別于真核生物的藻類）、能進行產(chǎn)氧光合作用的單細(xì)胞原核生物,，它的出現(xiàn)使整個地球大氣從無氧狀態(tài)發(fā)展到有氧狀態(tài),，從而孕育了好氧生物的進化和發(fā)展。這是氧氣與氫氣共存于同一生物體的最早證據(jù),。 氫化酶被發(fā)現(xiàn)是在20世紀(jì)30年代（Stephenson,，1931）。幾年后Gaffron等研究發(fā)現(xiàn)綠藻Scenedesmus sp.D.3在“暗反應(yīng)”中可以氧化氫氣同時固定二氧化碳（Gaffron, 1939 & 1940）,，或在光照下釋放氫氣（Gaffron, 1942）,。綠藻的細(xì)胞與高等植物相似，也有細(xì)胞核和葉綠體,，有相似的色素、貯藏養(yǎng)分及細(xì)胞壁的成分,。色素中以葉綠素a和b最多,，還有葉黃素和胡蘿卜素，故呈綠色,。這是最早在低等真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)氫氣代謝,。 現(xiàn)在很多研究集中在利用藻類產(chǎn)生氫氣作為生物能源,，關(guān)于低等植物氫氣代謝有大量的研究也已經(jīng)非常清楚。氫氣的產(chǎn)生和利用是由于藻類具有氫化酶,，在葉綠體中氫化酶可以與光合作用電子傳遞鏈的硫氧還蛋白（Fd）相互作用,，從Fd接受電子產(chǎn)生氫氣。近年來發(fā)現(xiàn)綠藻氫化酶的氫代謝與細(xì)胞的其他能量代謝也相關(guān)聯(lián)（Maione,，1986,；Wang，2020）,。 綠藻細(xì)胞中的氫化酶被激活后,，綠藻就能在進行光合作用時產(chǎn)生氫氣。然而這一過程非常微妙：氫化酶只能在缺氧環(huán)境下被激活,，一旦遇到氧氣,，氫化酶就迅速失去活性；正常情況下,，因為光合作用會產(chǎn)出氧氣,，氫酶總是處在失活狀態(tài)。實際上,，綠藻產(chǎn)氫更像是其在缺氧等“脅迫”情況下產(chǎn)生的一種應(yīng)激反應(yīng),。 2. 高等植物產(chǎn)生氫氣 高等真核生物葉綠體氫氣代謝的研究相對進展緩慢。1946年,，Boichenko在分離出的葉綠體發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生氫氣, 并推測在某些高等植物體內(nèi)也存在氫化酶（Boichenko,，1946）。1964年Renwick等在冬黑麥,、蘿卜,、豌豆、西紅柿等高等植物的種子萌發(fā)中發(fā)現(xiàn)可以產(chǎn)生氫氣（Renwick,，1964）,，并證明這并非是由于種子攜帶的微生物污染造成的。 1982年,，Mal'tsev S.V. 發(fā)現(xiàn)離體豌豆葉綠體能夠產(chǎn)生和消耗氫氣,，但并無后續(xù)研究，有關(guān)高等植物吸氫酶活性只有這1篇報道（Mal'tsev,，1982）,，遺憾的是我們僅能看到題目，估計是俄文文獻,，中間曾經(jīng)聯(lián)系雜志社均沒有信息,，未能找到全文，所以具體細(xì)節(jié)尚不清楚,。近年來,，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)水稻,、苜蓿和擬南芥等高等植物均可產(chǎn)生內(nèi)源性氫氣（Xie，2012,；Zeng,，2013；Jin,，2013）,，在植物的基因組中也發(fā)現(xiàn)一些基因與氫化酶基因同源，并監(jiān)測到植物中這些推測的氫化酶基因表達的變化,，但尚缺少這些基因蛋白表達水平的確認(rèn)和氫化酶功能的確認(rèn),。 到目前為止,，關(guān)于氫氣和線粒體的研究主要集中在氫氣清除線粒體產(chǎn)生的羥自由基保護線粒體方向,，還沒有檢索到線粒體產(chǎn)生或利用氫氣的報道，也就是說高等生物線粒體的氫代謝研究還是空白,。 由于有多個實驗研究證明種子萌發(fā)過程中可以產(chǎn)生氫氣,，我們首先用綠豆種子萌發(fā)（發(fā)綠豆芽）重復(fù)了這些實驗。已報道的測定種子萌發(fā)產(chǎn)氣的方法操作比較麻煩,，無法準(zhǔn)確定量,，我們嘗試幾種方案后干脆直接用氣相色譜使用的氣譜瓶培養(yǎng)種子和豆苗，然后取氣體樣品用氣相色譜檢測,，整個體系完全在一個密閉空間更方便準(zhǔn)確定量研究,。 分別將泡發(fā)后正常培養(yǎng)至0 h、24 h,、48 h,、72 h、96 h不同時間點的綠豆幼苗收集用于產(chǎn)氫的測定,，分別把上述樣品稱重消毒后加入裝有40 mL無菌水的氣相色譜瓶中,，一組氮氣排氧（排氧組）另一組不排氧（常氧組），25±1℃密封黑暗培養(yǎng)14 小時,，取1ml氣體用氣相色譜測定氫氣和氧氣的含量,。 結(jié)果如圖A所示，0h組的綠豆培養(yǎng)14小時后常氧和排氧兩組均未產(chǎn)生氫氣,，但常氧組的氧氣濃度已經(jīng)明顯下降（12.3% vs 21%）,。培養(yǎng)24h以上的幼苗在氣譜瓶培養(yǎng)14小時后耗氧比0h組明顯增大（6.7% vs 12.3%），并開始產(chǎn)生氫氣,。氮氣排氧之后,，樣品中氧氣濃度顯著降低，樣品在氣相色譜瓶中放置14 h后，剩余氧氣含量均低于2% (B),。排氧條件下48 h和72 h幼苗的產(chǎn)氫量顯著高于未排氧組(圖A)。 
氣相色譜檢測綠豆幼苗萌發(fā)過程中氫氣的產(chǎn)生,。A不同生長時期幼苗的產(chǎn)氫情況; B不同生長時期幼苗在氫氣檢測時同步檢測氧氣含量（Zhang X.,2020）
幼苗不同組織產(chǎn)氫情況,。（Zhang X.,2020） 取培養(yǎng)96小時的幼苗將根、下胚軸,、子葉+真葉分別在氣譜瓶中密閉暗培養(yǎng)14 h小時后檢測不同組織氫氣產(chǎn)生情況,。結(jié)果與整株幼苗類似，在低氧條件下它們都能產(chǎn)生氫氣,。一方面這個結(jié)果說明缺氧的環(huán)境對氫氣產(chǎn)生的重要性,；另一方面，根和下胚軸在種子萌發(fā)階段應(yīng)該沒有發(fā)育的葉綠體,，初步可以排除氫氣來源于葉綠體的可能性,，那么氫氣是從哪里來的呢？與其他研究類似,，我們也檢測了預(yù)測的幾個氫化酶基因在綠豆和辣椒種子萌發(fā)過程中在不同組織的表達情況,。發(fā)現(xiàn)根部和下胚軸中氫化酶表達都比子葉中要高，而且如果用氫水處理,，氫化酶基因的表達會受到抑制,。
預(yù)測氫化酶基因在綠豆萌發(fā)過程中的表達情況。除了下胚軸中VrHypA基因在第60h時表達量最高外（圖c）,，其余三個氫化酶同源基因VrNAR1,、VrHycB、VrFrhB均隨著培養(yǎng)時間延長,，表達量增加,，尤其在第120h時，轉(zhuǎn)錄水平達到最高值,。
氫水對預(yù)測氫化酶基因表達的影響（120小時）,。100% HRW能夠顯著降低辣椒幼苗的CaHycB和CaHypA基因的表達，在莖和葉中情況相同,，其余基因表達情況無顯著變化,。 以上通過對綠豆發(fā)芽過程的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)果基本重復(fù)了其他研究團隊的工作,，證明種子萌發(fā)過程中確實可以產(chǎn)生大量氫氣,。 我們進一步的細(xì)化研究證明包括根、下胚軸在內(nèi)的在種子萌發(fā)過程中不含葉綠體的組織都可以產(chǎn)生氫氣,，表明氫氣的來源可能是除葉綠體外的其他結(jié)構(gòu),。另外，我們建立了準(zhǔn)確檢測氫氣和氧氣變化的方法。這部分預(yù)實驗為后邊尋找氫氣來源的研究奠定了基礎(chǔ),。 下一篇將介紹線粒體產(chǎn)生氫氣的實驗數(shù)據(jù),。 氫氣生物學(xué)機理專題 氫生物學(xué)2020：機理研究探索
生命中的氫元素 氫氣是推動真核生物進化的關(guān)鍵
氫化酶
復(fù)合物 I 和氫化酶
氫氣與乙酰膽堿酯酶
氫氣與辣根過氧化物酶（1）
氫氣與辣根過氧化物酶（2）
寫在線粒體前
參考文獻 馬雪梅,張鑫,謝飛,趙鵬翔,張昭,儀楊,張曉康,馬勝男,李秦劍,呂寶北,劉夢昱,YAO Mawulikplimi Adzavon,孫學(xué)軍,李英賢.氫氣生物學(xué)作用的生物酶基礎(chǔ)[J].生物技術(shù)進展,2020,10(1):15-22.Zhang X, Zhang Zh, Wei Y, et al. Mitochondria in higher plants possess H2 evolving activity which is closely related to complex I [J/OL]. arXiv:2001.02132 [q-bio.BM], [2020-01-08]. https:///abs/2001.02132 線粒體產(chǎn)氫Zhang X, Zhang Zh, Su Z , et al. Hydrogen evolution and absorption phenomena in plasma membrane of higher plants [J/OL]. bioRxiv 2020.01.07.896852. [2020-01-08]. https:///cgi/content/short/2020.01.07.896852v1 細(xì)胞膜和氫氣Jacson DD, Ellms JW. On odors and tastes of surface waters with special reference to Anabaena, a microscopial organism found in certain water supplies of Massachusetts, Rep. Mass. State Board Health ,1896:410-420. 最早的藍(lán)藻產(chǎn)氫研究Stephenson M , Stickland L H . Hydrogenase: a bacterial enzyme activating molecular hydrogen: The properties of the enzyme.[J]. Biochemical Journal, 1931, 25(1):205. 發(fā)現(xiàn)氫化酶2 Gaffron H. Reduction of carbon dioxide with molecular hydrogen in green algae[J]. Nature, 1939, 143(1):204-205. 綠藻在“暗反應(yīng)”中氧化氫氣同時固定二氧化碳Gaffron H. The oxyhydrogen reaction in green algae and the reduction of carbon dioxide in the dark. [J]. Science, 1940, 91(2370):529-530. 綠藻在“暗反應(yīng)”中氧化氫氣同時固定二氧化碳Gaffron H, Rubin J. Fermentative and photochemical production of hydrogen in algae. J Gen Physiol 1942;26:219–40.綠藻在光照下釋放氫氣Stuart T S，Gaffron H . The Gas Exchange of Hydrogen-adapted Algae as Followed by Mass Spectrometry[J]. Plant physiology, 1972, 50(1):136-140.Boichenko E. Evolution of hydrogen by isolated chloroplasts [J]. Compt. Rend. Acad. Sci. USSR, 1946, 52 521-524. 發(fā)現(xiàn)藻類葉綠體產(chǎn)氫,，推測高等植物有氫化酶Renwick G M , Giumarro C , Siegel S M . Hydrogen Metabolism in Higher Plants[J]. Plant physiology, 1964, 39(3):303-306. 高等植物種子萌發(fā)可以產(chǎn)生氫氣2 Mal'tsev S V, Krasnovskii A A. Production and consumption of molecular hydrogen by isolated chloroplasts of higher plants [J]. Fiziologiya Rastenii (Moscow), 1982, 29 (5): 951-958. 發(fā)現(xiàn)離體豌豆葉綠體能夠產(chǎn)生和消耗氫氣Xie Y J, Yu M, Lai D W, et al. H2 Enhances Arabidopsis Salt Tolerance by Manipulating ZAT10/12-Mediated Antioxidant Defence and Controlling Sodium Exclusion [J]. Plos One, 2012, 7 (11): e49800. 植物產(chǎn)氫Zeng J, Zhang M, Sun X. Molecular Hydrogen Is Involved in Phytohormone Signaling and Stress Responses in Plants [J]. PloS one, 2013, 8 (8): e71038.植物產(chǎn)氫Jin Q, Zhu K, Cui W, et al. Hydrogen gas acts as a novel bioactive molecule in enhancing plant tolerance to paraquat-induced oxidative stress via the modulation of heme oxygenase-1 signalling system [J]. Plant Cell & Environment, 2013, 36 (5): 956-969.植物產(chǎn)氫Maione T E, Gibbs M. Hydrogenase-Mediated Activities in Isolated Chloroplasts of Chlamydomonas reinhardii [J]. Plant Physiology, 1986, 80 (2): 360-363.Wang Y , H Yang, Zhang X , et al. Microalgal Hydrogen Production[J]. Small Methods, 2020, 4. 微藻產(chǎn)氫綜述
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