CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)已成為合成生物學創(chuàng)新的典范,，但它具有一些主要局限性,。 可以對CRISPR-Cas9進行編程，以發(fā)現和切割特定的DNA片段,，但是編輯DNA以產生所需的突變需要誘使細胞使用新的DNA片段來修復斷裂,。 這種誘餌轉換可能很復雜，甚至可能對細胞有毒,，因為Cas9經常還會切割意外的脫靶位點,。

替代基因編輯技術稱為重組，而是通過在細胞復制其基因組時引入另一種DNA來執(zhí)行這種誘餌轉換,，從而有效地產生基因突變而不會破壞DNA,。 這些方法非常簡單，可以立即在許多細胞中使用,，以創(chuàng)建復雜的突變庫,，供研究人員進行研究。 但是,，要弄清楚這些突變的作用是什么,，就需要對每個突變體進行分離，測序和表征：這是一項耗時且不切實際的任務,。

哈佛大學和哈佛醫(yī)學院（HMS）的Wyss生物啟發(fā)工程研究所的研究人員創(chuàng)建了一種名為Retron Library Recombineering（RLR）的新基因編輯工具,，該工具使這項任務變得更加容易。  RLR同時生成多達數百萬個突變,，并對突變細胞進行“條形碼”,，以便可以一次篩選整個庫，從而可以輕松生成和分析大量數據,。 在PNAS中的最新論文中描述了在細菌細胞中已經實現的這一成就,。

共同第一作者說：“ RLR使我們能夠進行CRISPR不可能完成的工作：我們隨機切碎了一個細菌基因組,，將這些基因片段原位轉化為單鏈DNA，并利用它們同時篩選了數百萬個序列,?！?馬克斯·舒伯特（Max Schubert）博士，Wyss核心學院成員喬治·丘奇（George Church）博士后實驗室,。  “ RLR是一種更簡單,，更靈活的基因編輯工具，可用于高度多重實驗,，從而消除了CRISPR經常觀察到的毒性,，并提高了研究人員在基因組水平上探索突變的能力?！?/p>

回顧：從謎題到工程工具

逆轉錄是細菌DNA的片段,，它們經過逆轉錄產生單鏈DNA（ssDNA）的片段,。  Retrons的存在已有數十年之久,，但他們產生的ssDNA的功能卻從1980年代一直持續(xù)到2020年6月，當時一個團隊終于弄清了ssDNA能夠檢測出病毒是否感染了細胞,，從而構成了細菌免疫的一部分,。 系統(tǒng)。

雖然逆轉錄原本只是簡單地視為細菌的一個怪癖,，但研究人員在過去幾年中對它們越來越感興趣,，因為它們像CRISPR一樣，可以用于細菌,，酵母菌甚至人類細胞中的精確而靈活的基因編輯,。

“很長一段時間以來，CRISPR一直被認為是細菌所做的一件奇怪的事情,，并且弄清楚如何利用它進行基因組工程改變了世界,。逆轉錄是另一種細菌創(chuàng)新，也可能會提供一些重要的進步,，” Schubert說,。 由于其在細菌中產生ssDNA的能力，幾年前激起了他對Retron的興趣-這是一種在稱為寡核苷酸重組的基因編輯過程中使用的引人注目的功能,。

基于重組的基因編輯技術需要將包含所需突變的ssDNA整合到生物體的DNA中,，這可以通過以下兩種方式之一完成。 可在修復過程中對雙鏈DNA進行物理切割（例如,，使用CRISPR-Cas9）以誘導細胞將突變序列整合到其基因組中,，或者將突變DNA鏈和單鏈退火蛋白（SSAP） 將其引入正在復制的細胞中，以便SSAP將突變鏈整合到子細胞的DNA中,。

“我們認為逆轉錄應該使我們能夠在我們想要編輯的細胞內產生ssDNA,，而不是試圖將它們從外部強迫進入細胞內,，而又不會破壞天然DNA，這兩個都是非常引人注目的品質,，”研究人員說,。 第一作者丹尼爾·古德曼（Daniel Goodman）博士，曾任威斯研究所（Wyss Institute）研究生院研究員,，現為UCSF的簡·科芬·Childs博士后研究員,。

逆轉錄的另一個吸引人之處是它們的序列本身可以用作“條形碼”，以識別細菌池中的哪些個體已接收到每個逆轉錄序列,，從而可以顯著更快地匯總篩選精確創(chuàng)建的突變菌株,。

為了了解他們是否真的可以使用逆轉錄來實現與逆轉錄的有效重組，Schubert和他的同事首先創(chuàng)建了細菌DNA的環(huán)狀質粒,，該質粒包含位于逆轉錄序列中的抗生素抗性基因,，以及一個SSAP基因，可以將逆轉錄序列整合入 細菌基因組,。 他們將這些逆轉錄質粒插入到大腸桿菌中,，以查看在20代細胞復制后該基因是否成功整合到其基因組中。 最初,，少于0.1％的帶有逆轉錄重組系統(tǒng)的大腸桿菌摻入了所需的突變,。

為了改善這種令人失望的初始性能，研究小組對細菌進行了幾項基因調整,。 首先,，他們使細胞的天然錯配修復機制失活，該機制糾正了DNA復制錯誤,，因此可以在將其遺傳給下一代之前“固定”所需的突變,。 他們還使編碼外切核酸酶的兩個細菌基因失活-破壞自由浮動的ssDNA的酶。 這些變化極大地增加了整合逆轉錄序列的細菌比例,，達到了人口總數的90％以上,。

突變體的名稱標簽

既然他們確信自己的逆轉錄ssDNA已整合到細菌的基因組中，該團隊就測試了他們是否可以將逆轉錄用作基因測序的“捷徑”,，從而可以在混合物中進行許多實驗,。 因為每個質粒都有自己獨特的反轉錄序列，可以充當“名稱標簽”,，他們認為它們應該能夠對短得多的反轉錄序列進行測序,，而不是對整個細菌基因組進行測序，從而確定細胞已接受了哪些突變,。

首先,，研究小組測試了RLR是否可以檢測到大腸桿菌中已知的抗生素耐藥性突變。 他們發(fā)現,，與其他突變相比,，包含這些突變的序列在測序數據中的占比要高得多,。 研究小組還確定，RLR具有足夠的靈敏度和精確度,，可以測量由非常相似的突變引起的耐藥性的微小差異,。 至關重要的是，通過對整個細菌庫中的條形碼進行測序而不是對單個突變體進行分離和測序來收集這些數據,，可以極大地加快這一過程,。

然后，研究人員又將RLR向前走了一步,，看看它是否可以用于隨機片段化的DNA,，并找出它們一次可以使用多少個逆轉錄。 他們切碎了對另一種抗生素具有高度抵抗力的大腸桿菌菌株的基因組,，并利用這些片段建立了包含在質?；厮菪蛄兄械臄登f條基因序列的文庫。  “ RLR的簡單性在本實驗中確實得到了體現,，因為它使我們能夠建立一個比我們目前可用于CRISPR的庫更大的庫,，在該庫中我們必須合成指導基因和供體DNA序列才能誘導每個突變，” 舒伯特說,。

然后將該文庫引入RLR優(yōu)化的大腸桿菌菌株中進行分析,。 研究人員再一次發(fā)現,，通過對細菌庫進行測序,，它們相對于其他細菌富集的事實可以很容易地識別出賦予抗生素抗藥性的逆轉錄病毒。

高級作者喬治說：“能夠利用RLR分析合并的條形碼突變庫,，可以同時進行數百萬次實驗,，使我們能夠觀察到整個基因組突變的影響，以及這些突變之間如何相互作用,?！?丘奇（Church）領導威斯研究所（Wyss Institute）的合成生物學重點領域，同時還是HMS的遺傳學教授,。  “這項工作有助于建立在其他遺傳系統(tǒng)中使用RLR的路線圖,，這為未來的遺傳研究開辟了許多令人興奮的可能性?！?/p>

RLR與CRISPR區(qū)別的另一個特征是,，隨著細菌的復制，成功將所需突變整合到其基因組中的細菌比例會隨著時間的推移而增加,，而CRISPR的“單發(fā)”方法在首次嘗試時往往會成功或失敗,。 RLR可能與CRISPR結合使用以改善其編輯性能，或者可以在CRISPR有毒性的許多系統(tǒng)中用作替代方法,。

在RLR上還有更多工作要做,，以提高和標準化編輯率,，但是對于這種新工具的興趣正在增長。  RLR簡單,，流線型的性質可以研究多個突變如何相互影響,，并生成大量數據點，從而可以使用機器學習來預測進一步的突變效應,。

Wyss研究所創(chuàng)始主任Don Ingber博士說：“這種新的合成生物學工具將基因組工程提高到更高的通量水平,，這無疑將帶來新的，令人興奮的和意想不到的創(chuàng)新,?！? Ingber還是HMS和波士頓兒童醫(yī)院的Judah Folkman血管生物學教授，還是哈佛大學約翰·保爾森工程與應用科學學院的生物工程學教授,。

該論文的其他作者包括HMS的Timothy Wannier,，華威大學的Divjot Kaur，麻省理工學院的Fahim Farzadfard和Timothy Lu,，以及Gladstone數據科學和生物技術學院的Seth Shipman,。

這項研究得到了美國能源部（DE-FG02-02ER63445）和國防科學與工程研究生獎學金的支持。