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原名：Gene expression and functional deficits underlie TREM2-knockout microglia responses in human models of Alzheimer’s disease

譯名：阿爾茲海默病的TREM2模型中人類小膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)和功能缺陷

期刊：Nature Communications

IF：11.121

發(fā)表時(shí)間：2020年10月

通訊作者：Department of Neurobiology & Behavior， University of California Irvine

通訊作者單位：美國(guó)加州大學(xué)

DOI號(hào)：10.1038/s41467-020-19227-5

1   人類iPSC分化的小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2刺激與缺失的轉(zhuǎn)錄組差異

由于關(guān)于TREM2功能的初步報(bào)道表明AD相關(guān)的TREM2突變會(huì)導(dǎo)致部分功能缺失,，因此研究者通過(guò)生成三組等基因的CRISPR修飾的TREM2敲除的iPSC來(lái)模擬這種效果,。在小膠質(zhì)細(xì)胞分化后，通過(guò)western blot和均相時(shí)間分辨熒光（HTRF）分析驗(yàn)證了所有敲除細(xì)胞系中TREM2在蛋白水平上的表達(dá)缺失（圖1a）,。對(duì)條件培養(yǎng)基的HTRF分析進(jìn)一步表明,，可溶性TREM2只在WT中分泌，而在TREM2敲除細(xì)胞系中不分泌（圖1b）,，這提示野生型iPSC分化的小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出TREM2的正常運(yùn)輸和定位,，并進(jìn)一步證實(shí)了TREM2在KO系中缺乏表達(dá)。

接下來(lái),，研究者通過(guò)RNA-seq來(lái)確定人類TREM2 KO小膠質(zhì)細(xì)胞中被破壞的基因和通路,。兩組獨(dú)立的TREM2等基因小膠質(zhì)細(xì)胞由兩個(gè)不同的患者產(chǎn)生，以解釋任何細(xì)胞系依賴的影響（圖1c-1e）,。雖然兩個(gè)等基因組之間存在一些差異,，但許多轉(zhuǎn)錄本在兩個(gè)KO系中表現(xiàn)出相同的變化。最終鑒定出390個(gè)差異表達(dá)基因,，富集于包括“鈣介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控”和“ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)反應(yīng),，以及細(xì)胞遷移”等重要通路（圖1c-1e）。正如預(yù)期,，敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞中最顯著下調(diào)的基因是TREM2本身,，其次是糖蛋白NMB （GPNMB），該蛋白最近被證明在斑塊相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞中上調(diào)（圖1d）,。有趣的是,，GPNMB表達(dá)缺失可導(dǎo)致原發(fā)性皮膚淀粉樣變性，提示GPNMB可能在清除淀粉樣蛋白方面發(fā)揮重要作用,。與最近對(duì)AD小鼠的研究一致,，TREM2缺失也導(dǎo)致APOE和APOC1基因表達(dá)的顯著降低。

因?yàn)?/span>TREM2在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)的一些關(guān)鍵的下游結(jié)果可能只在TREM2信號(hào)被激活時(shí)才表現(xiàn)出來(lái),，所以研究者試圖確定一種驅(qū)動(dòng)野生型細(xì)胞中TREM2信號(hào)的最佳方法,，并使用TREM2 KO小膠質(zhì)細(xì)胞作為陰性對(duì)照，以進(jìn)一步驗(yàn)證該方法的特異性,。多種配體被認(rèn)為可以激活TREM2下游信號(hào),，包括APOE、β淀粉樣蛋白,、磷脂酰絲氨酸和其他幾種脂質(zhì),，然而這些配體都具有多效性，與多種受體和途徑結(jié)合并傳遞信號(hào),。另一方面,，當(dāng)用死去的iPSC衍生神經(jīng)元片段刺激TREM2 WT和KO細(xì)胞時(shí),，兩種基因型的反應(yīng)相似，這表明TREM2對(duì)神經(jīng)元碎片的特異性反應(yīng)可能被其他小膠質(zhì)細(xì)胞受體介導(dǎo)的信號(hào)所掩蓋,，如TAM受體酪氨酸激酶家族,。由于發(fā)現(xiàn)TREM2的表達(dá)并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性地改變小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)死亡神經(jīng)元的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，研究者得出結(jié)論,，需要一種更具體的方法來(lái)激活TREM2以進(jìn)一步研究TREM2的功能,。

因此，選擇使用一種市售的TREM2多克隆抗體（R&D;AF1828）,。類似的方案已被證明對(duì)各種免疫受體的激活有用,，這種特定的抗體已被成功地用于通過(guò)裂解熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)量化TREM2/DAP12信號(hào)?？紤]到人們對(duì)開(kāi)發(fā)TREM2激活抗體作為一種潛在的AD治療方法的興趣越來(lái)越大,，這種方法也可以為進(jìn)一步的轉(zhuǎn)化研究提供數(shù)據(jù)。由于小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)Fc受體,，當(dāng)量濃度的免疫前IgG被用作額外的同型對(duì)照,。通過(guò)這種方法，研究者證實(shí)AF1828暴露可使脾臟酪氨酸激酶（SYK）快速磷酸化,，SYK是已知的TREM2/DAP12激活的下游信號(hào)分子（圖1f,，g）。相比之下,，用IgG處理WT細(xì)胞或用AF1828處理TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞都不產(chǎn)生SYK磷酸化（圖1g）。

接下來(lái),，將這種刺激方法與RNA測(cè)序相結(jié)合,，以確定在抗體刺激24小時(shí)后 WT和KO小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)發(fā)生改變的基因（圖1h-j）。其中一些基因,，在缺乏TREM2時(shí)轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)降低,，而在抗體刺激的WT細(xì)胞中表達(dá)增加，但在對(duì)照組IgG或載體（DPBS）處理下沒(méi)有改變,。對(duì)這些高度特異性的差異基因進(jìn)行富集分析,，發(fā)現(xiàn)與敲除TREM2時(shí)的富集結(jié)果相似（圖1e，j）,，這72個(gè)差異基因也強(qiáng)調(diào)了趨化性（白細(xì)胞趨化性的正向調(diào)節(jié)）,、特異性免疫反應(yīng)家族（細(xì)胞對(duì)腫瘤壞死因子的反應(yīng)）和細(xì)胞生存途徑（ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)的正向調(diào)節(jié)）（圖1e，j）,。

為了從功能上驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn),，研究者下一步研究了TREM2的表達(dá)和信號(hào)通路是否會(huì)像富集分析預(yù)測(cè)的一樣改變小膠質(zhì)細(xì)胞的生存、吞噬和趨化作用,。

圖1.TREM2敲除和刺激可引起iPS衍生的小膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄變化,。a.等基因TREM2敲除系的western blot和均勻時(shí)間分辨熒光驗(yàn)證,。b. sTREM2由HTRF分泌。c. TREM2 WT與KO的DEG熱圖,。d. 火山圖顯示TREM2 WT與KO在兩條獨(dú)立直線上的DEG,。e. WT與KO基因集富集分析。f. TREM2抗體刺激范式示意圖,。g. Western blot顯示,，在多克隆TREM2抗體(AF1828)或?qū)φ誌gG暴露5-15分鐘內(nèi)，WT(深藍(lán)色)和KO(淡藍(lán)色)小膠質(zhì)細(xì)胞中的SYK發(fā)生磷酸化,。h.用IgG和抗TERM2抗體處理24 h后,，WT和KO小膠質(zhì)細(xì)胞與WT小膠質(zhì)細(xì)胞差異表達(dá)基因的Venn圖。i.互變基因的基因集富集分析,。j. 72個(gè)互變基因的熱圖,。

2   TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)應(yīng)激引起的細(xì)胞死亡敏感

從之前的富集分析中，研究者發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和凋亡的MAPK和ERK通路強(qiáng)烈富集（圖1e,，i）,。此外，此前來(lái)自小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)據(jù)表明,，TREM2缺乏導(dǎo)致細(xì)胞死亡增加,，這一過(guò)程被假設(shè)依賴于巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）。有研究表明,，TREM2與CSF1R信號(hào)通路協(xié)同工作,，而CSF1R信號(hào)通路對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的存活至關(guān)重要。因此,，研究者通過(guò)3天的細(xì)胞因子饑餓誘導(dǎo)人類iPS-小膠質(zhì)細(xì)胞死亡,，并檢測(cè)三種關(guān)鍵細(xì)胞因子（MCSF、IL-34和TGF-β1）在小膠質(zhì)細(xì)胞凋亡中的重要性（圖2a）,。

采用熒光caspase 3/7檢測(cè)工具和延時(shí)成像技術(shù)觀察小膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡,。在基線水平發(fā)現(xiàn)與WT等基因?qū)ο啾龋琓REM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)顯示出增加的caspase信號(hào),，這并不奇怪,，因?yàn)榧词乖跊](méi)有刺激的WT和KO系比較時(shí)，MAPK和ERK通路也豐富（圖1e,，2b）,。

在完全培養(yǎng)基（無(wú)細(xì)胞因子饑餓）中，WT小膠質(zhì)細(xì)胞的延時(shí)成像顯示caspase激活程度與預(yù)期相符（圖2a,，c,，深藍(lán)色）。然而,，在TREM2 KO細(xì)胞系中,，即使在完全培養(yǎng)基中也出現(xiàn)了凋亡增加,，這表明它們可能比WT細(xì)胞系對(duì)細(xì)胞因子有更高的依賴性（圖2a，c,，藍(lán)色）,。正如預(yù)期的那樣，細(xì)胞因子饑餓（去除M-CSF,、IL-34和TGF-β1）在WT和KO細(xì)胞系中誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞死亡,。然而，與WT系相比,，TREM2 KO系仍然表現(xiàn)出caspase 3/7信號(hào)的升高（圖2a,，c，紅色）,，表明TREM2 KO小膠質(zhì)細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)應(yīng)激條件的敏感性,，并通過(guò)凋亡作出反應(yīng)。

為了確定這種凋亡反應(yīng)是否通過(guò)M-CSF/CSF1R信號(hào)特異性發(fā)生,，研究者在僅缺乏CSF1R配體（有IL-34和M-CSF）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)人類iPS-小膠質(zhì)細(xì)胞,。發(fā)現(xiàn)，僅這一項(xiàng)就足以引起與完全細(xì)胞因子饑餓時(shí)相同水平的細(xì)胞凋亡（圖2a,，c,，橘色）。相比之下,，單獨(dú)去除TGF-β1并不能改變caspase的激活（圖2a,，c，灰色）,。因此,，研究者得出結(jié)論，人類TREM2調(diào)節(jié)CSF1R信號(hào)通路,，導(dǎo)致TREM2敲除系中更高水平的細(xì)胞死亡。

圖2. TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞在基線和細(xì)胞因子饑餓后表現(xiàn)出caspase激活降低,。a.在完全培養(yǎng)基(藍(lán)色),，缺少TGFB1(灰色)，缺少IL-34,，缺少M(fèi)CSF(橙色)或缺少IL-34,，缺少M(fèi)CSF，缺少TGFB1(紅色)培養(yǎng)3天的Caspase 3/7水平成像,。b. 培養(yǎng)0 h后caspase 3/7的定量,。c. 培養(yǎng)72 h后caspase 3/7的定量。

3   TREM2是人類小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬載脂蛋白E所必需的

載脂蛋白E （APOE）是AD最大的遺傳危險(xiǎn)因素,，被認(rèn)為是重要的TREM2配體,。然而,，目前尚不清楚APOE介導(dǎo)的疾病風(fēng)險(xiǎn)是否與它和TREM2的相互作用相關(guān)。此外,，本研究測(cè)序數(shù)據(jù)突出了脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的差異（圖1e）,，促使進(jìn)一步研究TREM2和APOE之間潛在的相互作用。因此,，將TREM2等基因細(xì)胞系暴露于一系列外源重組的脂化APOE中（圖3a）,。

有趣的是，研究者發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)APOE的吞噬依賴于APOE的基因型,，APOE4的內(nèi)化率明顯高于APOE3,，而APOE3的內(nèi)化水平高于APOE2（圖3a）。重要的是,，所有這些吞噬作用的差異是基于外源性添加蛋白的APOE基因型,，而不是小膠質(zhì)細(xì)胞自身的APOE基因型。研究者需要進(jìn)一步的研究來(lái)確定這是否對(duì)AD的發(fā)展至關(guān)重要,，但是這一數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)了APOE的不同基因型被小膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)別識(shí)別,。

接下來(lái)，研究了TREM2表達(dá)對(duì)APOE吞噬的重要性,。當(dāng)TREM2表達(dá)缺失時(shí),，研究者檢測(cè)到APOE熒光吸收不顯著高于載體對(duì)照（圖3a）?？紤]到TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞仍然表達(dá)其他典型的APOE受體,，這種明顯的差異令人驚訝。事實(shí)上,，RNA測(cè)序顯示,，包括LDL2、LRP1和HSPG2在內(nèi)的典型APOE受體的表達(dá)在細(xì)胞系之間沒(méi)有變化,。因此,，即使在其他APOE受體存在的情況下,，TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞也不會(huì)吞噬可檢測(cè)到的脂化APOE蛋白,，這表明TREM2是人類小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬APOE所必需的。

為了進(jìn)一步了解TREM2信號(hào)通路在APOE吞噬中的作用,，研究者還用SYK抑制劑R406預(yù)處理了iPS-小膠質(zhì)細(xì)胞來(lái)阻斷TREM2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（圖1f）,。在這些實(shí)驗(yàn)中使用了APOE最常見(jiàn)的突變體APOE3。用R406預(yù)處理小膠質(zhì)細(xì)胞可以部分但顯著地阻斷APOE在WT細(xì)胞中的吞噬作用,，表明這種吞噬作用確實(shí)是通過(guò)TREM2/DAP12信號(hào)通路發(fā)生的（圖3b）,。

4   TREM2對(duì)吞噬纖維-淀粉樣蛋白和人類突觸體至關(guān)重要，但對(duì)吞噬酵母聚糖A沒(méi)有作用

由于TREM2被認(rèn)為是體內(nèi)被小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬的許多配體的受體,，所以研究者將TREM2等基因細(xì)胞系暴露于其他幾種底物中，以測(cè)試是否會(huì)揭示相應(yīng)的功能差異,。首先,，將TREM2等基因細(xì)胞系暴露于纖維-淀粉樣蛋白。正如預(yù)期的那樣,，KO系中β -淀粉樣蛋白的吞噬量顯著降低（圖1c）。通過(guò)用R406阻斷SYK,，進(jìn)一步證實(shí)了對(duì)TREM2/DAP12下游信號(hào)通路的需求,。重要的是，在TREM2 KO細(xì)胞系中阻斷SYK沒(méi)有效果（圖1c）,。

為了驗(yàn)證之前表明TREM2可能在突觸修剪中發(fā)揮作用的研究,，研究者接下來(lái)將小膠質(zhì)細(xì)胞暴露于分離自AD腦組織的pHrodo標(biāo)記的人類突觸中。有趣的是,，TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)突觸小體的吞噬作用受損，表明TREM2可能在突觸修剪中發(fā)揮了重要作用（圖3d）,。同樣,，用R406通過(guò)SYK阻斷下游的TREM2信號(hào)可以部分阻斷WT系中突觸體的吞噬，這凸顯了TREM2/DAP12信號(hào)在吞噬該配體中的重要性,。

為了研究所觀察到的吞噬功能下降是僅限于疾病相關(guān)的底物,，還是代表了更全面的吞噬活性下調(diào)，研究者測(cè)試了對(duì)酵母聚糖A （dectin 1/2激動(dòng)劑）的吞噬功能（圖3e）,。這種對(duì)照配體被WT和TREM2敲除細(xì)胞吸收得同樣好,，并且SYK抑制不會(huì)改變酵母聚糖A的吞噬，這表明TREM2信號(hào)的丟失導(dǎo)致底物特異性吞噬缺陷（圖3e）,。

5   TREM2抗體刺激會(huì)部分改變吞噬功能

為了進(jìn)一步探索TREM2 KO細(xì)胞系的吞噬缺陷,，研究人員先用TREM2抗體預(yù)刺激等基因小膠質(zhì)細(xì)胞，并用IgG作為對(duì)照,，再將細(xì)胞暴露于APOE3,、β -淀粉樣蛋白、突觸體或酵母聚糖A,。正如預(yù)期的那樣,，TREM2抗體處理的TREM2敲除株沒(méi)有任何效果。TREM2抗體處理的WT細(xì)胞降低了對(duì)于APOE3和人突觸體的吞噬作用,，這種減少可能是由于抗體刺激后的內(nèi)化作用,，在二次刺激反應(yīng)中臨時(shí)模擬了功能表型的喪失。對(duì)于β-淀粉樣蛋白和酵母聚糖A,，TREM2抗體沒(méi)有作用,，這表明TREM2受體本身可能不直接負(fù)責(zé)開(kāi)始吞噬這些底物。然而,，在β-淀粉樣蛋白的情況下,，研究者確實(shí)顯示SYK信號(hào)是重要的（圖3c）。這一發(fā)現(xiàn)與之前對(duì)其他幾個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞受體的鑒定相吻合,，這些受體與小膠質(zhì)細(xì)胞的β -淀粉樣蛋白內(nèi)化有關(guān),。此外，這可能表明,，與TREM2和β-淀粉樣蛋白的直接結(jié)合相比,，SYK激活狀態(tài)的變化可能更強(qiáng)烈地影響TREM2中β -淀粉樣蛋白吞噬的減少。

6   TREM2缺失減少了淀粉樣斑塊周圍的聚集,，并損害了向產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白培養(yǎng)物的遷移

幾個(gè)小組之前已經(jīng)表明,，TREM2缺陷小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞在β淀粉樣斑塊周圍聚集減少。為了確定人類TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞是否存在類似的損傷,，研究者將表達(dá)GFP或RFP的等基因人類小膠質(zhì)細(xì)胞移植到5x-MITRG小鼠的大腦中（圖4a）,。這些5x-MITRG轉(zhuǎn)基因小鼠由5x-fAD小鼠與MITRG異種移植相容小鼠（hCSF1, hCSF2,hTPO, Rag2基因敲除，il2rγ基因敲除）回交獲得,，以檢測(cè)移植的人小膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)的功能行為,。利用這種方法，將WT和TREM2基因敲除的人類小膠質(zhì)細(xì)胞組合（GFP:WT, RFP:TREM2 KO或反之）共移植到2-3只6個(gè)月大的小鼠中,。腦切片用硫黃素S類似物Amylo-Glo染色,，以檢測(cè)纖維-淀粉樣斑塊。正如預(yù)期的那樣,，WT人類小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)β-淀粉樣斑塊病理表現(xiàn)出穩(wěn)健的反應(yīng),，以一種與在人類AD組織中觀察到的高度相似的方式包圍斑塊。與之形成鮮明對(duì)比的是，TREM2基因敲除的人類小膠質(zhì)細(xì)胞似乎對(duì)斑塊病理無(wú)反應(yīng),，與斑塊很少或幾乎沒(méi)有關(guān)聯(lián),，而且缺乏等基因野生型小膠質(zhì)細(xì)胞中觀察到的特征性形態(tài)學(xué)變化（圖4a）。這些數(shù)據(jù)與小鼠TREM2敲除小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)斑塊病理的反應(yīng)以及在人類TREM2 R47H病例中的觀察結(jié)果高度一致,，但也代表了所知的第一份研究TREM2缺失對(duì)人類小膠質(zhì)細(xì)胞斑塊關(guān)聯(lián)影響的報(bào)告,。

因?yàn)椋隗w內(nèi),，β-淀粉樣斑塊是相當(dāng)復(fù)雜的,，不僅包括β-淀粉樣蛋白本身，還包括許多其他蛋白,、營(yíng)養(yǎng)不良神經(jīng)突和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞,，所以進(jìn)行了體外遷移試驗(yàn)，以確定TREM2敲除細(xì)胞是否僅表現(xiàn)出向β -淀粉樣蛋白遷移的受損,，或者AD神經(jīng)元產(chǎn)生的額外信號(hào)是否可能進(jìn)一步影響小膠質(zhì)細(xì)胞和斑塊病理之間的聯(lián)系。為此,，使用了雙腔微流體遷移裝置來(lái)測(cè)量WT和KO小膠質(zhì)細(xì)胞向可溶性β-淀粉樣蛋白或產(chǎn)生人類神經(jīng)元/膠質(zhì)混合培養(yǎng)物的β-淀粉樣蛋白的遷移,。雖然野生型和KO小膠質(zhì)細(xì)胞在向Aβ_1-40或Aβ_1-42單獨(dú)遷移時(shí)沒(méi)有觀察到顯著差異，但Aβ_1-40和Aβ_1-42更多的生理組合揭示了TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移的顯著障礙（圖4b）,。

為了確定額外的神經(jīng)來(lái)源線索是否可能影響TREM2介導(dǎo)的趨化性,，研究者還分析了小膠質(zhì)細(xì)胞向產(chǎn)生Aβ的人類神經(jīng)元和中央腔內(nèi)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。通過(guò)將3周的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞共同培養(yǎng),，盡管TREM2敲除遷移已經(jīng)明顯受損,，還是觀察到極小的小膠質(zhì)細(xì)胞募集（圖4c）。然而,，當(dāng)神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育到9周時(shí)（之前的研究表明該系統(tǒng)中淀粉樣病變和細(xì)胞死亡增加的時(shí)間點(diǎn)）,，觀察到WT小膠質(zhì)細(xì)胞顯著遷移到中央室，而TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)這些細(xì)胞來(lái)源的趨化信號(hào)完全沒(méi)有反應(yīng)（圖4c）,。

一個(gè)突出的問(wèn)題是,，觀察到的遷移缺陷是由于TREM2敲除細(xì)胞無(wú)法感知和響應(yīng)化學(xué)吸引線索，還是僅僅是TREM2敲除細(xì)胞無(wú)法移動(dòng),。為了解決這個(gè)問(wèn)題,，研究者進(jìn)行了劃痕實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察TREM2 WT和KO小膠質(zhì)細(xì)胞的一般運(yùn)動(dòng)性。本實(shí)驗(yàn)顯示W(wǎng)T和TREM2敲除小膠質(zhì)細(xì)胞的基線運(yùn)動(dòng)沒(méi)有顯著差異,，這表明上述量化的差異是特異性的趨化遷移（圖4d）,。

7   CXCR4介導(dǎo)TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移缺陷

為了進(jìn)一步研究TREM2 KO小膠質(zhì)細(xì)胞遷移受損的機(jī)制,，返回到RNA-seq數(shù)據(jù)中，發(fā)現(xiàn)一個(gè)重要的化學(xué)吸引受體CXCR4的表達(dá)在TREM2敲除細(xì)胞中減少,。對(duì)等基因的WT和TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)分析,，進(jìn)一步證實(shí)該受體在TREM2敲除株的蛋白水平上下降（圖5a，b）,。更有趣的是,，CXCR4在小鼠疾病相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞（DAMs）和最近對(duì)斑塊相關(guān)的人類小膠質(zhì)細(xì)胞的研究中都表現(xiàn)為表達(dá)量增加，進(jìn)一步支持了該受體在小膠質(zhì)細(xì)胞向斑塊遷移中的潛在作用,。CXCR4也被認(rèn)為是外周免疫系統(tǒng)的趨化因子受體,，響應(yīng)配體SDF-1α （CXCL12）。CXCR4是一種典型的G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）,，它的參與導(dǎo)致G_q/11的激活,，隨后通過(guò)IP3介導(dǎo)的ER-store釋放提高胞漿Ca²⁺，這是一種下游反應(yīng),，也涉及到TREM2信號(hào),。在大腦中，SDF-1α在神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá),，特別是在海馬區(qū),，SDF-1α的增加促進(jìn)了AD小鼠斑塊的小膠質(zhì)細(xì)胞的招募。

為了研究CXCR4信號(hào)在iPS-小膠質(zhì)細(xì)胞中的潛在作用,，用Fluo-4和Fura-Red誘導(dǎo)細(xì)胞以用于比率Ca²⁺成像,，并在無(wú)Ca²⁺緩沖液中使用SDF-1α處理，以明確地分離通過(guò)CXCR4激活的下游Ca²⁺信號(hào),。通過(guò)這種方法,，發(fā)現(xiàn)WT小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)SDF-1α的反應(yīng)顯著高于TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖5c）。對(duì)單個(gè)細(xì)胞反應(yīng)的分析進(jìn)一步表明,，在WT和TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞中,，只有一小部分細(xì)胞被SDF-1α激活（圖5c），這表明,，只有一小部分小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)SDF-1α信號(hào)有反應(yīng),，而在TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞中,，這一比例顯著降低（WT中39%響應(yīng)，KO中11.5%響應(yīng)）,。單細(xì)胞定量顯示,，在TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞中，SDF-1α的平均Ca²⁺峰值響應(yīng)也較低（圖5c）,。這些結(jié)果強(qiáng)烈表明,，TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)SDF-1α的敏感性較低，這可能是由于觀察到的CXCR4 mRNA和膜定位的CXCR4蛋白表達(dá)較低,，這也可能解釋了它們的遷移缺陷,。

接下來(lái)，為了確定CXCR4信號(hào)是否對(duì)遷移有必要,，使用AMD3100阻斷CXCR4受體在小膠質(zhì)細(xì)胞向星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞遷移過(guò)程中的活性,。先前的數(shù)據(jù)強(qiáng)調(diào)，這種神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的混合模型確實(shí)表達(dá)了SDF-1α,，此外,，與健康對(duì)照組相比，使用產(chǎn)生Aβ的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)SDF-1α表達(dá)增加,。觀察到WT小膠質(zhì)細(xì)胞僅在SDF-1α被誘導(dǎo)（AD神經(jīng)元）且CXCR4信號(hào)功能正常的培養(yǎng)環(huán)境中遷移（圖5d）,。這些數(shù)據(jù)強(qiáng)烈表明CXCR4是人類小膠質(zhì)細(xì)胞向表達(dá)β-淀粉樣蛋白的神經(jīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移的必要條件。因此,，這些數(shù)據(jù)支持了一種可能性,，即在TREM2缺陷的小膠質(zhì)細(xì)胞中激活CXCR4可能是一種有助于小膠質(zhì)細(xì)胞向死亡細(xì)胞或淀粉樣斑塊遷移的方法。

圖5. REM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞缺乏CXCR4,，而CXCR4是遷移所必需的,。a. CXCR4(綠色)、IBA-1(紅色)在TREM2等基因系中的表達(dá),。b. CXCR4:APC的流式細(xì)胞術(shù),。c. 加載了熒光-4(綠色)和呋喃紅(紅色)的WT細(xì)胞和用SDF-1α激活的TREM2 KO細(xì)胞的最大強(qiáng)度投影圖像隨時(shí)間的疊加。d. WT小膠質(zhì)細(xì)胞被允許遷移到9周齡的健康或中央腔內(nèi)培養(yǎng)的產(chǎn)生β-淀粉樣蛋白(AD)神經(jīng)/膠質(zhì)細(xì)胞(白色虛線圈),。

8   TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)無(wú)法適當(dāng)應(yīng)對(duì)淀粉樣斑塊

研究表明,，在AD小鼠的DAM亞群中TREM2的表達(dá)增加，這是向這種表型轉(zhuǎn)變所必需的,。然而,，作者實(shí)驗(yàn)室和其他實(shí)驗(yàn)室的最新數(shù)據(jù)表明，與人類DAM形成相關(guān)的基因與先前定義的小鼠數(shù)據(jù)集有有限的重疊,。為了確定TREM2 KO是否影響人小膠質(zhì)細(xì)胞中DAM的形成,，將iPS來(lái)源的造血祖細(xì)胞共移植到出生后2-3天的MITRG小鼠幼鼠中，以便在同一只小鼠中直接比較WT和KO人小膠質(zhì)細(xì)胞,。為了鑒定哪些小膠質(zhì)來(lái)自TREM2 WT和敲除的iPSCs,，將表達(dá)RFP的WT細(xì)胞與表達(dá)GFP的KO細(xì)胞混合,，反之亦然。利用這項(xiàng)技術(shù),，發(fā)現(xiàn)人類小膠質(zhì)細(xì)胞可以長(zhǎng)期植入小鼠前腦,。當(dāng)與5xfAD小鼠雜交得到5x-MITRG時(shí)，還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞對(duì)疾病的發(fā)生和進(jìn)展做出了特有的形態(tài)學(xué)和轉(zhuǎn)錄改變,。在從6個(gè)月大的MITRG或5x-MITRG小鼠大腦中分離出人類小膠質(zhì)細(xì)胞后,，進(jìn)行了單細(xì)胞RNA測(cè)序，以觀察人類小膠質(zhì)細(xì)胞的亞群,。在未患病的MITRG小鼠中，研究者發(fā)現(xiàn)了4個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的小膠質(zhì)細(xì)胞亞群（圖6a）,。通過(guò)分析每個(gè)群體中與整個(gè)數(shù)據(jù)集最顯著不同的基因,，確定了這四個(gè)亞群體的差異基因涉及：主要組織相容性復(fù)合體（MHCII）和人類白細(xì)胞抗原（HLA）呈遞（34.2%），I型干擾素應(yīng)答（10.8%）,，一個(gè)定義模糊的“degranulation”的小亞群（1.9%）,，和一個(gè)“內(nèi)穩(wěn)態(tài)”簇，表達(dá)高水平的典型和內(nèi)穩(wěn)態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞基因,，但缺乏定義其他簇的基因表達(dá)（53.1%）（圖6a）,。然而，將TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞移植到同種小鼠時(shí),，發(fā)現(xiàn),，即使在非患病小鼠中，這些亞群的百分比也朝著更穩(wěn)定的方向變化（圖6a）,，這與TREM2缺失可能使小膠質(zhì)細(xì)胞陷入內(nèi)穩(wěn)態(tài)的觀點(diǎn)一致,，不僅是在疾病中，也存在于對(duì)正常衰老的反應(yīng)中,，這表明TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞在本質(zhì)上是低反應(yīng)性的,。

接下來(lái)，研究者檢查了WT和TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞,，這些小膠質(zhì)細(xì)胞已被共移植到同窩的5x-MITRG小鼠幼鼠中,，并允許其生長(zhǎng)6個(gè)月。當(dāng)檢測(cè)移植到AD模型的WT小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí),，研究者發(fā)現(xiàn)了5個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的亞群（圖6b）,。在非AD小鼠中發(fā)現(xiàn)的4個(gè)亞群仍然存在，另外還有一個(gè)亞群與最近描述的人類DAM類群相匹配,。正如預(yù)期的那樣,，暴露于β-淀粉樣病變后，WT小膠質(zhì)細(xì)胞從穩(wěn)態(tài)和干擾素高表型轉(zhuǎn)向了DAM表型（圖6a）,。

然而,，當(dāng)檢測(cè)移植到AD模型中的TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí),，研究者發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞未能正常激活，AD小鼠中77%的TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞保持穩(wěn)態(tài),，只有1.8%的小膠質(zhì)細(xì)胞向DAM亞型轉(zhuǎn)變,。作者還注意到TREM2 KO小膠質(zhì)細(xì)胞中HLA簇的富集程度降低了約2倍。因此,，人類TREM2基因敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞在對(duì)β-淀粉樣蛋白病理反應(yīng)方面表現(xiàn)出與小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞類似的損傷,，盡管這個(gè)丟失的“DAM”群體的精確基因集僅部分與小鼠對(duì)應(yīng)基因集重疊（約12%）。

9   TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)不形成DAMs

由于單細(xì)胞測(cè)序是對(duì)每個(gè)基因型的一種動(dòng)物進(jìn)行的,，而且RNA并不總是與蛋白質(zhì)表達(dá)直接相關(guān),。接下來(lái)研究者試圖通過(guò)在更大隊(duì)列的小鼠中檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)來(lái)證實(shí)研究的結(jié)果,。為了驗(yàn)證發(fā)現(xiàn),，即在AD模型腦的WT細(xì)胞中CD9表達(dá)增加，研究者對(duì)所有4組動(dòng)物（MITRG + WT, MITRG + KO, 5xMITRG + WT, 5x-MITRG + KO）進(jìn)行了CD9（DAM亞群的標(biāo)記基因）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),。同樣,，使用共移植的動(dòng)物，來(lái)自同一個(gè)大腦的細(xì)胞可以通過(guò)GFP或RFP表達(dá)來(lái)分離,，以表示TREM2基因型圖（圖6c）,，這一分析證實(shí)了非患病動(dòng)物（MITRG）表達(dá)非常低水平的CD9蛋白。研究者還證實(shí)AD模型腦（5x-MITRG）中WT細(xì)胞的CD9水平明顯高于來(lái)自同一大腦的KO細(xì)胞,。事實(shí)上,，在非疾病和AD模型大腦中，KO細(xì)胞的CD9陽(yáng)性DAM數(shù)量沒(méi)有顯著差異（圖6c）,。這再次表明,，盡管暴露于β-淀粉樣病變，TREM2 KO細(xì)胞仍被鎖定在內(nèi)穩(wěn)態(tài),。由于這些細(xì)胞是從WT和KO細(xì)胞共移植的大腦中分離出來(lái)的,，這些結(jié)果也表明，激活的WT細(xì)胞的存在不足以在附近的KO細(xì)胞中誘導(dǎo)DAM表型,。

為了進(jìn)一步在解剖水平上驗(yàn)證單細(xì)胞測(cè)序和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果,，研究者對(duì)同一共移植小鼠的大腦皮層切片進(jìn)行了檢查。HLA和DAM標(biāo)記物的表達(dá)在β-淀粉樣蛋白斑塊周圍特異性增加,，這與最近發(fā)表的文章一致,。作者強(qiáng)調(diào),，TREM2敲除的小膠質(zhì)細(xì)胞（GFP）在WT細(xì)胞（RFP）中并不表現(xiàn)出典型的斑塊相關(guān)的HLA標(biāo)記物（圖6d，HLA-DRB1）或DAM標(biāo)記物（圖6e,,，CD9）表達(dá)增加,，這與TREM2敲除細(xì)胞鎖定到一個(gè)更穩(wěn)定的表型的觀點(diǎn)一致。重要的是,，用相反的GFP/RFP細(xì)胞組合移植的小鼠顯示TREM2 KO （RFP）小膠質(zhì)細(xì)胞中CD9和HLA-DRB1的同等損失,。總之,，這些數(shù)據(jù)有力地表明,，人類TREM2基因敲除小膠質(zhì)細(xì)胞在體內(nèi)無(wú)法激活對(duì)β-淀粉樣斑塊的反應(yīng)。

本研究揭示了TREM2參與了CSF1R依賴的小膠質(zhì)細(xì)胞生存,、SYK依賴的突觸體吞噬,、β-淀粉樣蛋白和APOE以及CXCR4依賴的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移，人類DAM反應(yīng)的形成,，闡明了小膠質(zhì)細(xì)胞在人類AD進(jìn)展中可能的重要作用。