【原】關(guān)注！三篇Mol. Plant同時報道中國研究團隊對于基因編輯PAM位點的研究

微科享 2021-04-19

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推薦：江舜堯

編譯：Tracy An-q

編輯：馬莉

CRISPR/Cas系統(tǒng)是從原核生物中發(fā)現(xiàn)的一種防御外源性遺傳物質(zhì)入侵的自身免疫機制,，主要分為三種類型:Type I,、TypeII和Type III。而常用的CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由II型改造而來,，具有核酸酶活性,，并能夠通過向?qū)NA的作用靶向性結(jié)合生物基因組任何區(qū)域的目的基因，進而實現(xiàn)對目標基因的編輯,。該系統(tǒng)最早被開發(fā)并最成熟的是Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9),，它具有較高的切割活性和保真性，是目前研究最深入的Cas酶之一。它識別的序列需要臨近3’端有一段序列,，即PAM（protospaceradjacent motif）,。經(jīng)典的PAM是NGG，而非經(jīng)典PAM序列是NAG（N指 A/T/C/G）,。如何有效拓展 CRISPR- Cas9 核酸酶 PAM位點范圍,、實現(xiàn)對應(yīng) PAM 識別位點的高效及高特異基因組編輯，是 CRISPR- Cas9核酸酶在植物基因組編輯中廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵所在,。

近日,，國際知名植物學(xué)期刊Molecular Plant同一天在線發(fā)表了中國學(xué)者對基因編輯PAM位點研究的三篇論文，分別由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所周煥斌研究員課題組,，電子科技大學(xué)（成都）生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院張勇教授課題組以及中科院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康院士課題組完成,。

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所周煥斌研究員課題組發(fā)表了題為“Cas9-NG greatly expands the targeting scope of genome-editingtoolkit by recognizing NG and other atypical PAMs in rice”的研究論文，作者將最近報道,，在人類細胞基因組編輯中擴大了靶向空間Cas9-NG能夠識別最小的NG PAM,，對其在植物中進了研究。研究者以轉(zhuǎn)基因水稻內(nèi)源基因為靶點,，對Cas9-NG對各種NGNPAMs的核酸酶活性進行了評估,，發(fā)現(xiàn)Cas9-NG可以編輯所有活性受損的NGG、NGA,、NGT和NGC位點,，而基因編輯植株以單等位基因突變?yōu)橹鳌＿M一步開發(fā)了cas9 - ng工程基編輯器,，并用于生成OsBZR1功能增益植物,，這是其他可用的cas9 -工程基編輯器無法做到的。此外,，cas9 - ngbased轉(zhuǎn)錄激活因子能有效上調(diào)水稻內(nèi)源靶基因的表達,。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)Cas9-NG可以識別除NGPAM外的NAC,、NTG,、NTT、NCG,。這些結(jié)果表明,，Cas9-NG大大擴展了基因組編輯工具的靶向范圍，為植物的靶向基因組編輯,、堿基編輯和基因組調(diào)控提供了廣闊的應(yīng)用前景,。

電子科技大學(xué)（成都）生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院張勇教授課題組發(fā)表了題為“Improvingplant genome editing with high-fidelity xCas9 and non-canonical PAM-targetingCas9-NG”的研究論文，工程化的SpCas9（Streptococcuspyogenes Cas9）突變體,，即xCas9和Cas9-NG,，在改善靶向特異性和擴大靶向范圍方面有巨大的潛力,。在這項研究中，作者在模式植物水稻中評估了這些Cas9突變體,。他們首先測試xCas9（xCas9-3.7,，哺乳動物細胞中最有效的xCas9突變體），在所有16種可能的NGNPAM組合中進行重復(fù)的定向誘變,。xCas9在經(jīng)典NGGPAM位點上表現(xiàn)出與野生型Cas9（Cas9-WT）相當?shù)木庉嬓?，而在非?jīng)典NGH（H= A，C,，T）PAM位點具有有限的活性,。通過rAPOBEC1和PmCDA1胞苷脫氨酶進行C-T堿基編輯，進一步證明了NGCPAM中xCas9的高編輯效率,。對于不匹配的sgRNA，他們發(fā)現(xiàn)xCas9相比于Cas9-WT,，靶向特異性有所改善,。他們接下來測試了兩種用于靶向NGNPAMs的Cas9-NG突變體（Cas9-NGv1和Cas9-NG），發(fā)現(xiàn)兩種Cas9-NG突變體在許多非經(jīng)典NGPAM位點有著更高的編輯效率,，他們還在富含AT的PAM位點（如GAT,，GAA和CAA）上實現(xiàn)了高效編輯，遠遠超過了xCas9,。然而,，Cas9-NG突變體卻在經(jīng)典NGGPAM位點顯示出顯著降低的活性。在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因水稻品系中,，他們還證明了Cas9-NG在編輯NGPAM位點時具有比Cas9-NGv1和xCas9高得多的編輯效率,。為了擴大基礎(chǔ)編輯范圍，他們通過融合Cas9-NG切口酶（D10A）,、PmCDA1和UGI,，開發(fā)了一個高效的C- T基礎(chǔ)編輯系統(tǒng)。

中科院上海植物逆境生物學(xué)研究中心朱健康院士課題組發(fā)表了題為“Genomeengineering in rice using Cas9 variants that recognize NG PAM sequences”的研究論文,，研究者通過最近設(shè)計的兩個可以更輕松的識別NGPAMs的SpCas9變體：xCas9和SpCas9-NG,，并使用了穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因品系來評價xCas9和SpCas9-NG在水稻基因編輯和堿基編輯中的有效性。研究者發(fā)現(xiàn)xCas9可以有效地誘導(dǎo)水稻中NG和GATPAM序列的靶位點突變,。但是,，包含xCas9的基本編輯器無法編輯大多數(shù)測試的目標站點。SpCas9-NG在具有多種NGPAMs的位點表現(xiàn)出較強的編輯活性,，而對NG之后的第三個核苷酸沒有表現(xiàn)出任何偏好,。此外，研究者還發(fā)現(xiàn)xCas9和SpCas9-ng在CGGPAM位點上比SpCas9具有更高的特異性,。研究者證明,，不同形式的含有SpCas9-NG基因編輯器,，由于擴大了PAM位點的兼容性，因此可以有效地完成水稻基因工程工作,。因此,，研究者的工作產(chǎn)生了多用途的基因組工程工具，將顯著擴大水稻和其他作物的基因編輯目標范圍,。