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編譯：微科盟朱海珍,，編輯：微科盟木木夕、江舜堯,。 微科盟原創(chuàng)微文,，歡迎轉(zhuǎn)發(fā)轉(zhuǎn)載。 導(dǎo)讀喀斯特洞穴是一種分布廣泛的地下生態(tài)系統(tǒng),，微生物在推動洞穴發(fā)育與元素的生物地化學(xué)循環(huán)中發(fā)揮重要作用。以往的研究通過非培養(yǎng)方法探究了洞穴生態(tài)系統(tǒng)中的微生物群落,，但驗證測序數(shù)據(jù)得出的假設(shè)及揭示微生物在洞穴生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮的功能仍然需要進行大規(guī)模的菌株分離培養(yǎng),。本研究對貴州省兩個喀斯特洞穴中采集的樣品進行了大規(guī)模的細菌分離培養(yǎng)，并對其中的細菌新物種進行了全基因組測序,。結(jié)合從數(shù)據(jù)庫中獲得的洞穴分離已知物種的基因組,，構(gòu)建了洞穴分離培養(yǎng)細菌基因組數(shù)據(jù)集。通過將構(gòu)建的基因組數(shù)據(jù)集與宏基因組測序數(shù)據(jù)比較,，探究了細菌在洞穴碳氮硫元素循環(huán)中的代謝潛力,。在此過程中，發(fā)現(xiàn)洞穴細菌參與β-酮己二酸途徑降解4-羥基苯甲酸的3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶序列聚為兩簇,，選擇代表菌株對這兩類3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶進行了異源表達與酶活測定,。本研究報道了目前已知的最大規(guī)模的洞穴細菌資源庫，為今后洞穴生物地化學(xué)研究提供了寶貴信息與資源,。 原名：Bacteria and Metabolic Potential in Karst CavesRevealed by Intensive Bacterial Cultivation and Genome Assembly 譯名：大規(guī)模分離培養(yǎng)及基因組分析揭示喀斯特洞穴細菌代謝潛力 期刊：Applied and Environmental Microbiology IF：4.016發(fā)表時間：2021.1 通訊作者：劉雙江 通訊作者單位：中國科學(xué)院微生物研究所 本研究使用的樣品采集自貴州省遵義市綏陽縣寬闊水風(fēng)景區(qū)的兩個未開發(fā)洞穴,，樣品包括水、巖石,、沉積物三種類型,。將樣品用生理鹽水進行梯度稀釋，涂布R2A平板，30oC培養(yǎng),。平板上長出的菌落挑取后劃線純化,，用通用引物27F/1492R擴增近全長的16S rRNA基因測序。測序數(shù)據(jù)與NCBI的16S microbial database進行比對,，以相似性97% 為標準進行物種注釋,。對潛在的細菌新物種使用Biolog GEN III試劑盒檢測生化特征，利用透射電子顯微鏡觀察細胞形態(tài),，使用PacBio RS II平臺進行全基因組測序,。基因組數(shù)據(jù)使用ChunLab’s ANI計算器計算物種間的平均核苷酸相似性,，使用GGDC 2.1進行數(shù)字DNA-DNA雜交,。洞穴樣品的16S rRNA擴增子數(shù)據(jù)與宏基因組測序數(shù)據(jù)從NCBI的SRA中檢索下載。16S rRNA擴增子數(shù)據(jù)使用VSEARCH v11.0.667進行雙端合并及質(zhì)控,，使用QIIME v1.9.1去除非細菌序列及平均相對豐度低于0.00001的OTUs,。16S rRNA擴增子代表序列與分離培養(yǎng)菌株16S rRNA基因序列使用BLAST+ v2.10.1進行比對。宏基因組數(shù)據(jù)使用KneadData v0.7.4進行質(zhì)控,，丟棄質(zhì)控后序列數(shù)低于10,000的樣品,。使用MEGAHIT v1.2.9對質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進行組裝,，使用Prokka v1.14.6預(yù)測CDS,，然后用CD-HIT v4.8.1構(gòu)建非冗余基因集。使用Salmon v1.3.0對每個樣品中的基因進行定量,。分離培養(yǎng)群落的多樣性指數(shù)使用PAST計算,，主坐標分析使用vegan包，可視化使用ggplot2包,。3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶的異源表達使用pET-28a載體與E.coli BL21菌株,，酶活檢測使用分光光度法。檢測體系包含200 mM Tris-HCl (pH 8.0),，40 mM MgCl2,10 mM 3-氧代己二酸,，0.4 mM 琥珀酰-CoA，終體積為200 μl,。使用酶標儀檢測305 nm吸光度,，借助3-氧代己二酸-CoA:Mg2+的摩爾消光系數(shù)計算產(chǎn)物的生成。洞穴細菌的大規(guī)模分離培養(yǎng)和鑒定按照圖1a所示的流程進行,。本研究共獲得3,562株細菌,，其中1,408株分離自洞穴1；2,154株分離自洞穴2,。兩個洞穴的洞口距離僅500米,，地質(zhì)及氣候條件相似。以16S rRNA基因相似性97%為標準，3,562株細菌可以初步分為329個物種,，屬于102個屬,。洞穴1和洞穴2的樣品中各獲得225個和201個物種。其中,，128個物種僅從洞穴1的樣品中分離到,，104個物種僅從洞穴2的樣品中分離到，其它97個物種在兩個洞穴的樣品中都能分離到,。通過香農(nóng)指數(shù)分析,，從兩個洞穴分離的細菌群落沒有顯著差異（圖1b, Student’s ttest, p > 0.05）。將分離自不同類型洞穴樣品的細菌群落進行比較分析,，不同類型樣品中分離得到的細菌群落的香農(nóng)指數(shù)存在顯著差異（圖1c, ANOVA, F =6.509, p < 0.01）,。沉積物中細菌群落的α-多樣性顯著高于巖石樣品（Tukey HSD, p < 0.05）和水樣（Tukey HSD, p < 0.01）?；贐rey-Curtis距離矩陣的主坐標分析表明,，三種樣品中分離培養(yǎng)的細菌群落，其群落組成存在顯著差異（PERMANOVA, F =3.06, R2 = 0.135, p = 0.001）,。巖石樣品中的優(yōu)勢類群是放線菌,，沉積物樣品中變形菌、放線菌和厚壁菌的分布相對均勻,，水樣中則是變形菌占絕對優(yōu)勢,。129個物種分離自巖石樣品，155個物種分離自沉積物樣品,，133個物種分離自水樣,。
圖1 洞穴細菌分離培養(yǎng)流程（a）及其多樣性（b，c）,。
將來自兩個洞穴分離獲得的菌株作為一個整體,，其中最常分離到的是變形菌門的菌株，其次是放線菌門和厚壁菌門（圖2a）,。擬桿菌門和奇異球菌-棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）僅分離獲得了個別菌株,。在更細致的分類水平上，洞穴樣品中豐度最高的是短波單胞菌屬（Brevundimonas）,，α變形菌綱的柄桿菌屬（Caulobacter）和博斯氏菌屬（Bosea）,、γ變形菌綱的假單胞菌屬、放線菌門的鏈霉菌屬和紅球菌屬（Rhodococcus）,、厚壁菌門的芽孢桿菌屬也占較大的比例,。以16S rRNA基因相似性97%為標準，分離獲得的166個菌株屬于潛在的細菌新物種,，占所有分離菌株的4.7%,。這些新物種涉及以下各屬：節(jié)桿菌（Arthrobacter）,、固氮螺菌（Azospirillum）、短波單胞菌,、奇異球菌（Deinococcus）,、馬賽菌（Massilia）、甲基養(yǎng)菌（Methylibium）,、諾卡氏菌（Nocardioides）,、新草螺菌（Noviherbaspirillum）、油單胞菌（Oleomonas）,、類芽孢桿菌（Paenibacillus）,、類芽孢八疊球菌（Paenisporosarcina）、池塘桿菌（Piscinibacter）,、假古爾本基安菌（Pseudogulbenkiania）,、假單胞菌、土壤單胞菌（Solimonas）,、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）及扎瓦爾金氏菌（Zavarzinia）,。為了評估分離培養(yǎng)的細菌在整個洞穴細菌群落中的代表性，從NCBI數(shù)據(jù)庫中收集了4個非培養(yǎng)的洞穴樣品16S rRNA基因擴增子數(shù)據(jù)集,。其中數(shù)據(jù)集PRJNA497480的樣品采集自中國西南地區(qū)的8個喀斯特洞穴,，其地質(zhì)背景與本研究中的兩個洞穴比較相似。這4個數(shù)據(jù)集共包含153個樣品,，將其OTUs的代表序列與分離獲得的3,562個菌株的16S rRNA基因進行比對,，分離培養(yǎng)的菌株平均占各數(shù)據(jù)集相對豐度的28.7%-31.1%（圖2b），最高可代表樣品中序列的75%以上,。
圖2 洞穴分離細菌的物種分布（a）及其在16S rRNA擴增子數(shù)據(jù)集中的代表性（b）,。
從166株潛在細菌新物種菌株中選擇24個代表菌株,，檢查其菌落純度，并將16S rRNA基因與最新的在線數(shù)據(jù)庫（EzBioCloud和NCBI）進行比對,。不幸的是,，7個潛在新物種的代表菌株無法繼續(xù)傳代培養(yǎng)。菌株K2R10-124與K2W31S-24與在線數(shù)據(jù)庫中的序列相似性超過98%,；菌株K1W22B-3與K1W22B-8兩者的16S rRNA基因相似性達99%,，將其重新分類為同一個分類單元。對剩下的14個潛在新物種進行形態(tài)學(xué)觀察,、表型測定,、系統(tǒng)發(fā)育分析及基因組測序。這些菌株的形態(tài)及系統(tǒng)發(fā)育見圖3,，各菌株的命名見表1,。
圖3 洞穴潛在細菌新物種的形態(tài)（a）及基于16S rRNA基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（b）,。
如圖4a所示，與碳水化合物尤其是多糖相比,，洞穴新物種對短鏈脂肪酸和氨基酸的利用更為普遍,，盡管接近半數(shù)的菌株能夠利用D-果糖、D-果糖-磷酸和D-葡萄糖等單糖,。其它葡萄糖胺,、甘油及吐溫40等碳源也能夠被大多數(shù)洞穴潛在新物種利用。對洞穴分離的14株潛在新物種進行了全基因組測序,，獲得的基因組大小從2.5 Mb到6.5 Mb,，編碼的蛋白質(zhì)的數(shù)量為2,507到5,725個（表2）。將測序獲得的基因組根據(jù)直系同源基因簇（Clusters ofOrthologous Groups, COG）進行功能分類（圖4b）,。在信息存儲與處理方面,，大多數(shù)測序菌株在轉(zhuǎn)錄（COG-K）、翻譯（COG-J）及復(fù)制與修復(fù)（COG-L）方面的基因數(shù)量最多,。在細胞過程與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面,，參與細胞壁/被膜合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的基因豐度較高。在代謝方面,，氨基酸（COG-E）和脂質(zhì)（COG-I）可能是洞穴新物種更青睞的碳源,，另外，能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換（COG-C）,、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝（COG-P）在洞穴新物種的基因組中也非常豐富,。值得注意的是，這些新測序的基因組中還有大量未分類的基因有待進行進一步的功能探究,。
圖4 洞穴潛在細菌新物種的代謝概覽,。圖a為Biolog GEN III測得的碳源利用情況，紫色代表陽性,，白色代表陰性,；圖b為14個新測序基因組的COGs分布情況，基因相對豐度最高的為粉色,，最低的為綠色,。
如圖4b所示，14株測序的洞穴細菌物種中11株有鞭毛,，基因組數(shù)據(jù)挖掘的結(jié)果也支持這一結(jié)果,。對于生存條件復(fù)雜且營養(yǎng)匱乏的細菌來說，能夠向有利的環(huán)境移動（趨化）對其生存至關(guān)重要,。所有11株有鞭毛的菌株其基因組上都存在編碼趨化受體,、組氨酸激酶CheA及其受體CheW的基因，趨化受體的數(shù)量從2個（K2R01-6和K1W22B-7）到46個（K2W22B-5）不等,。據(jù)報道,，形成生物膜也是洞穴細菌的生存策略之一,。9株新測序的菌株基因組上有與生物膜形成相關(guān)的胞外多糖生物合成的基因。近期研究表明,，細菌的趨化與生物膜合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)存在交互作用,，洞穴細菌可能通過協(xié)調(diào)其行為來適應(yīng)環(huán)境。
4 分離細菌基因組及宏基因組數(shù)據(jù)預(yù)測洞穴生物地化學(xué)循環(huán)相關(guān)的代謝潛力為了獲得對洞穴細菌代謝潛力的宏觀認識,，構(gòu)建了一個洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集,。這個數(shù)據(jù)集包括新測序的14個基因組與204個數(shù)據(jù)庫中獲得的與本研究分離菌株相同物種的基因組。這些數(shù)據(jù)代表了整個分離培養(yǎng)類群的218個物種,，在整個分離培養(yǎng)類群中的相對豐度為72.32%,。CD-HIT軟件從洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集中共識別到1,060,824個基因，聚類為一個包含857,889條代表性序列的非冗余基因集,。將這個非冗余洞穴細菌基因集使用KEGG數(shù)據(jù)庫進行注釋,，共鑒定到7,476個直系同源組（KOs）。這些基因豐度最高的是基因信息處理（14.6%）相關(guān)的,，其次還有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細胞過程（11.4%）,、碳水化合物代謝（9.4%）、氨基酸代謝（7.7%）,、能量代謝（4.1%）等過程的相關(guān)基因,。另外，本研究收集了8個喀斯特洞穴沉積物,、石筍,、巖石表面樣品的宏基因組數(shù)據(jù)。這些功能注釋結(jié)合分離菌株的相對豐度揭示了洞穴細菌獨特的碳,、氮,、硫代謝特征。4.1碳代謝,。洞穴細菌群落在有機碳利用方面,，值得注意的是芳香化合物（aromatic hydrocarbon, AH）和聚羥基丁酸（poly-β-hydroxybutyrate, PHB）（圖35a）。35.8%的分離培養(yǎng)菌株具備從乙酰輔酶A（acetyl-CoA）合成PHB的潛力,，33.3%的基因組也有PHB解聚的第一個基因,。以往的研究表明，石筍能夠捕獲多環(huán)芳烴,，芳香化合物可能是洞穴生態(tài)系統(tǒng)重要的碳源和能源之一。在本研究的數(shù)據(jù)集中,，很多基因組有通過β-酮基己二酸（beta- ketoadipate）途徑降解4-羥基苯甲酸（4-hydroxy-benzoate）的一系列基因,，但是在整個數(shù)據(jù)集中卻沒有注釋到3-氧代己二酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶（3-oxoadipate CoA-transferase）基因。根據(jù)統(tǒng)計結(jié)果,，57個基因組（平均相對豐度26%）能夠氧化CO,，這表明CO可能是洞穴細菌生長的重要電子供體,。由于CO能夠結(jié)合金屬蛋白，對很多生物是有毒性的,，但是CO作為電子供體,，電勢很高，因此在一些極端環(huán)境中可以作為重要的能源或/和能源,。值得注意的是,，目前唯一已培養(yǎng)的大氣甲烷氧化菌USCα類群，即洞穴大氣甲烷氧化菌USCγ在酸性環(huán)境中的對應(yīng)類群,，也被證實能夠利用CO作為能量來源,。在厭氧碳代謝中，微生物參與的CO氧化通常與乙酸或甲烷的產(chǎn)生過程偶聯(lián),。但是在好氧條件下,，也就是本研究使用的分離培養(yǎng)條件，CO既可以作為補充能源物質(zhì)而不轉(zhuǎn)化為生物質(zhì),，也可以為卡爾文-本森（Calvin-Benson-Bassham,CBB）循環(huán)固定CO2提供能源,。因此，本研究也統(tǒng)計了洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集中的rbcL基因,，這個基因編碼通過CBB途徑固定CO2的Rubisco大亞基,。rbcL基因存在于數(shù)據(jù)集的30個基因組中，相對豐度為14.9%,。新物種油單胞菌K1W22B-8的基因組可以作為CO氧化相關(guān)的基因示例,。菌株K1W22B-8基因組中的cox基因簇包含CO脫氫酶的結(jié)構(gòu)基因（coxMSL）、膜結(jié)合的ATP酶基因（coxD）,、參與Mo=S基團形成的類xdhC基因（coxF和coxI）,。將K1W22B-8基因組上的cox基因簇與羧基營養(yǎng)型細菌嗜碳寡養(yǎng)菌（Oligotrophacarboxidovorans OM5）的基因組進行比較，K1W22B-8的基因組上缺乏將CO脫氫酶錨定在細胞質(zhì)膜上的基因（coxB, coxC, coxH and coxK）,，這說明兩個菌株的CO脫氫酶可能在細胞定位上存在差異,。有趣的是，在K1W22B-8基因組上cox基因簇的上游,，有一個類可溶型甲烷單加氧酶基因簇（soluble methanemonooxygenase-like gene cluster, smoXYB1C1Z）,。據(jù)報道，該基因簇在某分枝桿菌菌株中表現(xiàn)出氧化C2到C4短鏈烷烴的能力,。與分離培養(yǎng)的基因組數(shù)據(jù)集一致,，宏基因組數(shù)據(jù)中與PHB合成與解聚、4HB降解及CO氧化相關(guān)的基因同樣分布廣泛且數(shù)量豐富（圖5b）,。在分離培養(yǎng)的基因組數(shù)據(jù)集中,，參與PHB合成的三個基因在80個細菌基因組中都存在，而乙酰乙酰-CoA還原酶（PhaB,，K00023）在8個洞穴宏基因組數(shù)據(jù)中都沒有注釋到,。CO脫氫酶基因在各個洞穴宏基因組數(shù)據(jù)中的分布各不相同,，采集自葡萄牙的洞穴樣品展現(xiàn)出比其他洞穴樣品更高的CO氧化潛力。4.2氮代謝,。在洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集中,，NtrC家族的雙組分系統(tǒng)在88個細菌基因組中都存在，表明在氮代謝過程中存在密集的調(diào)控,。洞穴分離細菌基因組數(shù)據(jù)集中有11個基因組有生物固氮的潛力(圖5c),，其中一個分離自水樣的新的固氮螺菌（Azospirillum）新類群豐度較高，可作為這一功能類群的代表,。固氮螺菌K2W22B-5的基因組上具備所有三個固氮的關(guān)鍵操縱子：nifHDK, nifENX和nifUSV,，分別編碼固氮酶（nitrogenase）的結(jié)構(gòu)基因、固氮酶的鉬輔因子和鐵硫簇,。與其它固氮螺菌基因組上的基因排布方式相似,，在nifENX操縱子的下游有一個nif特異的鐵氧還蛋白III（nif-specificferredoxin III）編碼基因fdxB，在nifUSV操縱子與nifW基因（編碼固氮酶穩(wěn)定/保護蛋白）之間有一個編碼絲氨酸O-乙?；D(zhuǎn)移酶（serine O-acetyltransferase）的cysE基因,。每固定1分子氮氣要消耗16分子ATP，為了在一定程度上補償這一耗能的過程,，固氮菌有一系列氫化酶（hydrogenase）基因,，氧化固氮的副產(chǎn)物氫氣。氧氣耐受的鎳鐵氫化酶（[NiFe]-hydrogenase）在細菌中廣泛存在,，其編碼基因hyaAB也存在與菌株K2W22B-5的基因組中,。一半以上分離培養(yǎng)的洞穴菌株有進行異化型硝酸鹽還原的潛力。菌株K2W22B-5基因組中參與異化型硝酸鹽還原到亞硝酸鹽的基因簇是napABCDE,，它編碼位于周質(zhì)空間的硝酸鹽還原酶,；但是數(shù)據(jù)集中其它基因組中跟多的是narGHI，編碼能夠在還原反應(yīng)過程中產(chǎn)生質(zhì)子驅(qū)動力的膜結(jié)合的硝酸鹽還原酶,。菌株K2W22B-5基因組中參與異化型亞硝酸鹽還原成氨的基因簇是nirBD,，編碼硝酸鹽/亞硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白的基因是nrtABCD。對洞穴宏基因組數(shù)據(jù)的分析沒有找到完整的異化型硝酸鹽還原酶（圖5d）,。這些數(shù)據(jù)集有些缺少膜結(jié)合的硝酸鹽還原酶（Nar I,，K00374）的γ亞基，有些缺少周質(zhì)空間硝酸鹽還原酶（Nap B,，K02568）的電子傳遞亞基,。亞硝酸鹽還原相關(guān)的基因在所有8個宏基因組數(shù)據(jù)集中都廣泛存在且數(shù)量豐富。固氮酶基因在各個洞穴宏基因組數(shù)據(jù)中的分布各不相同,，采集自夏威夷的洞穴樣品展現(xiàn)出比其他洞穴樣品更高的固氮潛力,。4.3硫代謝。盡管洞穴分離菌株基因組的數(shù)據(jù)集中沒有參與異化型硫酸鹽還原的基因,，洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集與洞穴宏基因組數(shù)據(jù)中都有參與同化型硫酸鹽/亞硫酸鹽還原及硫代硫酸鹽還原到硫化氫的基因（圖5e和5f）,。在洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集中，71.1%的菌株有將硫代硫酸鹽氧化成亞硫酸鹽的潛力,，36.1%的菌株有氧化亞硫酸鹽的潛力,。
圖5 洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集（a，c,，e）及洞穴宏基因組數(shù)據(jù)（b,，d，f）與C/N/S循環(huán)相關(guān)的代謝潛力,。圖a,，c，e中不同顏色的箭頭表示不同功能類型的物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程,，箭頭的粗細與能進行該轉(zhuǎn)化步驟的物種數(shù)相關(guān),，虛線表示數(shù)據(jù)集中沒有進行該轉(zhuǎn)化步驟的基因，箭頭上的數(shù)字和百分比分別表示能進行該轉(zhuǎn)化步驟的物種數(shù)及其相對豐度,；圖b,，d，f中的基因根據(jù)TPM值著色,。
5 洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集中“丟失的”3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶的鑒定根據(jù)前面的預(yù)測,，芳香化合物降解的β-酮己二酸途徑在洞穴分離細菌基因組數(shù)據(jù)集及宏基因組數(shù)據(jù)中都普遍存在且豐度較高。然而,，編碼3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶的基因（pcaIJ）在分離細菌基因組數(shù)據(jù)集中沒有注釋到,。用宏基因組數(shù)據(jù)中注釋到的pcaIJ基因與分離細菌基因組數(shù)據(jù)集進行比對，比對到16個序列相似性大于47%的基因,，這些基因可能是潛在的pcaIJ,。根據(jù)NCBI及KEGG注釋，人工檢查了基因組數(shù)據(jù)集,，篩選出所有參與β-酮己二酸途徑的連續(xù)的基因簇,，共獲得55個基因組可能攜帶潛在的3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶編碼基因,。代表菌株K2W22B-5及K1R23-30中的相關(guān)基因分布如圖6a所示,。pcaI和pcaJ分別編碼3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶的兩個亞基,，將這兩個基因從55個基因組中提取出來,，將兩者串聯(lián)起來進行系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明,，潛在的3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶聚成兩個大的分支，其中Cluster I包含26個潛在的基因,，主要來源于研究較多的假單胞菌,；Cluster II包含29個潛在的基因,，物種來源比較多樣（圖6c）。從兩個分支中各選擇一個代表菌株,，對其潛在的pcaIJ基因進行異源表達純化,，得到的產(chǎn)物均表現(xiàn)出3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶活性（圖6d）,。
圖6 β-酮己二酸途徑相關(guān)基因（a）及其物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程（b）,，3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶編碼基因聚類（c）及其代表序列的酶活測定（d）。圖a中的紅色百分比表示洞穴分離菌株與ATCC 35469對應(yīng)酶的氨基酸序列相似性,；圖d中的對照包含三種情況：檢測體系不加酶,，檢測體系加K5PcaIJ不加琥珀酰-CoA,，檢測體系加30PcaIJ不加琥珀酰-CoA,。
以往研究表明，對洞穴微生物的分離培養(yǎng)存在挑戰(zhàn)，因為營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基會對適應(yīng)寡營養(yǎng)洞穴的細胞造成滲透壓力。為了更好地分離培養(yǎng)洞穴細菌,，本工作選擇了R2A培養(yǎng)基,。據(jù)報道,，營養(yǎng)物質(zhì)濃度較低的R2A在盡可能多地培養(yǎng)異養(yǎng)菌時比PCA培養(yǎng)基和TSA培養(yǎng)基更有優(yōu)勢,。與常用的基于形態(tài)差異的分離培養(yǎng)方法不同,，本工作挑取了盡可能多的菌落,，使得物種豐度在一定程度上是有意義的。盡管將培養(yǎng)基進行稀釋,、采用更低的培養(yǎng)溫度,、延長培養(yǎng)時間等方法也許能夠獲得更多的細菌物種，但本研究仍然獲得了一個很大的洞穴細菌資源庫,。通過與16S rRNA基因擴增子測序數(shù)據(jù)比較，分離獲得的菌株代表了整個洞穴細菌群落的主要部分,。本研究分離頻率最高的是變形菌門,、放線菌門和厚壁菌門的菌株，也獲得了擬桿菌門和奇異球菌-棲熱菌門的個別菌株,。在屬水平上,，短波單胞菌是本工作中最常分離到的類群，也是墨西哥另一寡營養(yǎng)洞穴中的典型代表菌株,。盡管本研究采樣的兩個洞穴沒有進行過旅游開發(fā)，但分離獲得了大量芽孢桿菌和類芽孢桿菌,，這些類群在其它開放洞穴的研究中也有報道。微生物代謝是洞穴生態(tài)系統(tǒng)生物地化學(xué)循環(huán)的重要驅(qū)動力,。非培養(yǎng)的方法預(yù)測了洞穴微生物群落的代謝潛力，但尚未解決哪些微生物發(fā)揮哪些功能的問題。本研究結(jié)合基因組測序與數(shù)據(jù)庫挖掘,，構(gòu)建了包含218個洞穴分離細菌基因組的數(shù)據(jù)集,，并解析了其在C/N/S循環(huán)過程中的代謝潛力特征,。例如，洞穴新物種油單胞菌及固氮螺菌的CO氧化與固氮潛力可能減輕了洞穴環(huán)境的碳氮匱乏。在營養(yǎng)條件受限的環(huán)境中,，微生物被迫利用一切可以獲得的營養(yǎng)物質(zhì)生存,。據(jù)報道,，Movile洞穴中的很多細菌都能利用C1化合物生長。除了油單胞菌,，本研究也獲得了一些兼性甲基營養(yǎng)型的菌株,。近年來，存在于洞穴環(huán)境中的一個未培養(yǎng)的大氣甲烷氧化類群備受關(guān)注。盡管油單胞菌的甲烷氧化能力沒有驗證,，但這些菌株存在氧化C2-C4化合物的潛力,，為探究洞穴微生物烷烴氧化提供了新的角度,。β-酮己二酸途徑廣泛存在于土壤細菌和真菌中，但喀斯特洞穴微生物參與該途徑的潛力尚未報道,。本研究在洞穴細菌基因組數(shù)據(jù)集及宏基因組數(shù)據(jù)集中均觀察到大量參與β-酮己二酸途徑的基因，并進一步驗證了該途徑中兩類3-氧代己二酸-CoA轉(zhuǎn)移酶的活性,。這些結(jié)果展示了傳統(tǒng)分離培養(yǎng)與測序數(shù)據(jù)結(jié)合的強大力量，新表征的pcaIJ基因也將為提高測序數(shù)據(jù)的準確性提供有價值的信息。
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