膿毒癥是全身炎癥宿主反應(yīng)感染和器官功能障礙所引起的,，在臨床上具有高度異質(zhì)性。通常治療預(yù)后的失敗被認(rèn)為是由于膿毒癥患者的異質(zhì)性,，因此不能在分子生物學(xué)水平上對膿毒癥患者進(jìn)行準(zhǔn)確分類所造成的,。先前的研究試圖通過臨床特征或生物標(biāo)記物識別不同的亞型，但這些膿毒癥分類研究尚未發(fā)現(xiàn)不同亞型的機(jī)制,。由于m6A是參與整個生物過程（包括免疫,，代謝，增殖和凋亡）調(diào)控的最常見的轉(zhuǎn)錄后RNA修飾,，膿毒癥中的異質(zhì)性可能與m6A RNA調(diào)控有關(guān),。以前的研究已經(jīng)證明了M6A調(diào)控與腫瘤的異質(zhì)性。然而參與異質(zhì)性膿毒癥的m6A RNA調(diào)節(jié)因子的機(jī)制尚未解開,。

圖1.篩選數(shù)據(jù)集流程圖

經(jīng)過上圖的搜索策略和篩選標(biāo)準(zhǔn)的選擇,，來自烏特勒支大學(xué)醫(yī)學(xué)中心和阿姆斯特丹學(xué)術(shù)醫(yī)學(xué)中心的一個mRNA數(shù)據(jù)集最終被納入本研究,。該數(shù)據(jù)集中共有479位患者均年齡超過18歲，并被診斷患有敗血癥,。敗血性休克率為34.8％,，患者基本信息如下：

表1人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床特征

作者首先從公開發(fā)表的文獻(xiàn)整理出十六個M6A RNA甲基化調(diào)控名單，然后將列表限定在GEO數(shù)據(jù)集中有可用RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的基因,，剩下十二個m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子,。這些m6A RNA調(diào)節(jié)因子包括m6A writers, m6A readers and m6A erasers，具體組成如表2,。

表2. 12種m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子

對12個m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子進(jìn)行單變量Cox回歸分析發(fā)現(xiàn),，ALKBH5,，HNRNPC，KIAA1429,，WTAP和YTHDF2與28天累積死亡率顯著相關(guān)（P <0.05）,。ALKBH5和WTAP是危險比（HR）> 1的危險基因，而HNRNPC,，KIAA1429和YTHDF2是HR <1的保護(hù)性基因,。

圖2.預(yù)后的m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子

m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子相關(guān)性結(jié)果：

圖3.12個m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子表達(dá)相關(guān)性

圖4. k = 2–9的共識熱圖

從m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)相似性結(jié)果可見，k=2或3時比較合適,，此時亞型穩(wěn)定性從k=2增至隊(duì)列中的9,。

KM分析表明三種亞型之間28天的累積死亡率存在顯著差異（P = 0.004）。但兩種亞型之間的28天累積死亡率未顯示出明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P = 0.092）,，考慮到KM曲線和亞型穩(wěn)定性,，敗血癥患者最終分為三種亞型（亞型1，亞型2和亞型3）,。

圖5.五個m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的膿毒癥預(yù)后亞型

在膿毒癥隊(duì)列中,，亞型 3的患者有最佳的預(yù)后結(jié)局。在28天時,，亞型 3的144人中有21人死亡（14.6％）（HR vs.所有其他亞型 5.42,，95％CI : 0.359–0.819,；P = 0.011）,，相比之下，224個亞型 1中的57人（25％）（HR 0.579,，95％CI：0.364–0.920,；P = 0.037）和112人中的36人（23％）亞型 2（HR 0.477，95％CI：0.272–0.833; P = 0.003）,。

m6A每個亞型的調(diào)節(jié)圖中顯示不同的表達(dá)模式（P <0.05）,，在GSEA和CIBERSORT分析下，亞型之間免疫狀態(tài)的有明顯異質(zhì)性,。

圖6.m6A調(diào)節(jié)子分布的異質(zhì)性和亞型間宿主反應(yīng)的差異

免疫狀態(tài)的異質(zhì)性包括免疫細(xì)胞中富集分?jǐn)?shù)的顯著差異和促炎性細(xì)胞因子表達(dá)的明顯差異,。在亞型 1（中度預(yù)后）中，與其他亞型相比,，免疫增強(qiáng)細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子顯著上調(diào),，同時免疫抑制細(xì)胞也下調(diào)（P <0.05）。亞型 2（預(yù)后最差）中免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子的分布與亞型1中的分布完全相反（P <0.05）,。亞型3（預(yù)后最好）中免疫細(xì)胞的富集得分和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)處于亞型1和亞型2的中間,。

圖7.WGCNA中各種軟閾值能力

通過WGCNA在膿毒癥患者隊(duì)列中確定出24個模塊。亞型1與17模塊（包括1,860個基因）正相關(guān),，相關(guān)系數(shù)為0.73,，P值為8×10 -81,。亞型2與1模塊（包括3,423個基因）顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.68,，P值為8×10 -70,。亞型3與21模塊（包括251個基因）顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.61,，P值為8×10 -51,。這些高度相關(guān)模塊的基因定義為每種亞型的本征基因。

圖8.WGCNA的24個共表達(dá)基因模塊的層次聚類樹

為進(jìn)一步探索模塊的生物學(xué)功能,，進(jìn)行了GO富集分析,，結(jié)果如下圖所示。十七模塊（與亞型 1相關(guān)）的生物學(xué)功能主要參與在RNA加工和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)中富集,。一模塊（與亞型2相關(guān)）主要與核苷酸修復(fù)和細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān),。二十一模塊（與亞型3相關(guān)）主要與自噬有關(guān)。

圖9.亞型之間的生物學(xué)功能

共表達(dá)分析進(jìn)一步確定了82個免疫分子和40個自噬相關(guān)分子可以通過預(yù)后的m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子來調(diào)節(jié),，P <0.05且相關(guān)系數(shù)> 0.6,。免疫分子和自噬相關(guān)分子分別來自免疫學(xué)數(shù)據(jù)庫（https://www./）和人自噬數(shù)據(jù)庫（http://www./）。

圖10.具有免疫和自噬相關(guān)基因的預(yù)后m6A RNA甲基化調(diào)節(jié)因子的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

在本研究中,，作者首先根據(jù)GEO數(shù)據(jù)集篩選膿毒癥患者基因表達(dá)數(shù)據(jù)集，通過系統(tǒng)綜述確定了12個m6A甲基化調(diào)節(jié)基因,。利用共識k-means聚類方法在m6A預(yù)后分子的膿毒癥中鑒定m6A三種不同的亞型,，并評估了這些亞型與臨床特征和生存結(jié)果的關(guān)聯(lián)。隨后通過基因集富集分析,、加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析,，GO分析和共表達(dá)分析，表明分型之間具有不同的RNA表觀遺傳學(xué),，免疫狀態(tài),，生物學(xué)過程和結(jié)果，膿毒癥的異質(zhì)性可能主要由m6A RNA甲基化引起,。