Nature：復(fù)雜菌群空間分布研究

Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities

（圖1：文章信息簡介。圖片來源：截圖）

Article, 2020-12-02

Nature,[IF 42.778]

doi: 10.1038/s41586-020-2983-4

原文鏈接：https://www./articles/s41586-020-2983-4

第一作者：Hao Shi

通訊作者：Hao Shi;Iwijn De Vlaminck

主要單位：美國紐約伊薩卡康奈爾大學(xué)Nancy E. and Peter C. Meinig生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院（Nancy E. and Peter C. Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, Ithaca, NY, USA）

摘要

Abstract

由于環(huán)境菌群物種密度大,、多樣性高,，以及光學(xué)成像技術(shù)的局限性，實現(xiàn)原位繪制復(fù)雜微生物群落高系統(tǒng)發(fā)育分辨率和空間分辨率的生物地理圖譜是一項重大挑戰(zhàn),。在此研究人員介紹了全新的高系統(tǒng)發(fā)育分辨率微生物組繪圖熒光原位雜交技術(shù)(HiPR-FISH),，這是一種使用二進制編碼、光譜成像和機器學(xué)習(xí)解碼創(chuàng)建復(fù)雜群落中數(shù)百個微生物物種的位置和身份的微米尺度地圖的多功能技術(shù),。研究人員發(fā)現(xiàn)10位HiPR-FISH可以區(qū)分1023個用獨特的二元條形碼熒光標(biāo)記的大腸桿菌,。HiPR-FISH結(jié)合自動探針設(shè)計和自定義的單細胞圖像分析算法，揭示了抗生素治療對小鼠腸道微生物組空間網(wǎng)絡(luò)的破壞,，以及人類口腔菌斑微生物組空間結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,。HiPR-FISH與超分辨率成像相結(jié)合，展示了人類口腔微生物中核糖體的不同組織策略。HiPR-FISH提供了一個以單細胞分辨率分析環(huán)境微生物群落空間生態(tài)的框架,。

引言

Introduction

自然環(huán)境中分布著大量體積微小,，種類、數(shù)量繁多的微生物,，它們因為各自獨特的生存方式和相互作用關(guān)系構(gòu)成一定的空間分布結(jié)構(gòu),。了解生態(tài)系統(tǒng)中菌群的空間分布有助于研究各種細菌的生理功能以及菌群之間、菌群和宿主之間的相互作用關(guān)系,。

目前研究菌群空間分布的核心技術(shù)是熒光原位雜交技術(shù),，這項技術(shù)通過熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針與固定樣品中的DNA或RNA結(jié)合顯示菌群的位置分布[1]。由于每條探針僅標(biāo)記一種熒光基團與細菌直接結(jié)合,，并且能夠同時成像的熒光基團數(shù)量有限,，空間定位的菌群譜系分辨率低，極大地限制了復(fù)雜菌群多菌種同時定位的研究,。盡管之前有研究[2]使用多熒光基團組合標(biāo)記結(jié)合光譜成像的方法,，使用八種熒光基團組合標(biāo)記的方式在人類牙菌斑生物膜樣本中15個類群進行成像分析，一定程度上突破了技術(shù)障礙,，但這種方法仍然不足以應(yīng)對復(fù)雜環(huán)境中大量菌群的定位研究,，同時由于需要設(shè)計合成大量熒光基團標(biāo)記的探針，成本高,、過程繁瑣,。迄今為止的腸道菌群空間分布研究大多是定性研究，少量定量研究的分析方法都十分粗糙,，并且這些方法不能提供單細胞水平的空間信息,。

基于以上的研究背景和存在的問題，在Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities這篇文獻中,，研究人員提出了一種通過二進制編碼,、光譜成像、機器學(xué)習(xí)解碼的高譜系分辨率定位菌群的熒光原位雜交技術(shù)（HiPR-FISH）,，這種技術(shù)能夠在微米尺度上創(chuàng)建復(fù)雜群落中數(shù)百個微生物物種的位置和身份地圖,，同時實現(xiàn)單細胞定量檢測[3]。

（圖2：HiPR-FISH方法流程圖,，圖片來源：參考文獻[1]）

原理簡介

為了使盡可能少的熒光基團同時標(biāo)記盡可能多的細菌,，研究人員首先對十種熒光基團進行二進制編碼。有或無某種熒光基團對應(yīng)二進制編碼中的1或0：存在某種熒光基團記為1,，不存在記為0.以ABC三種熒光基團二進制編碼組合為例,，排除一種熒光基團都沒有結(jié)合、無法成像的組合,，三種熒光基團一共能組合出2³-1=7種組合方式,。同樣地,，十種熒光基團能夠組合出2¹⁰-1即1023種熒光基團的組合方式，使用這些各不相同的已知熒光基團組合就能區(qū)別標(biāo)記不同的細菌,。這1023種組合方式中,，有的只有1種熒光基團，有的有5種,，有的10種都有,。由于每種熒光基團的發(fā)射光譜不同，每一種獨特的熒光基團組合成像的光譜各不相同,，最終可以根據(jù)這唯一的光譜解析出對應(yīng)的細菌種類,。

（圖3：熒光基團的二進制。圖片來源：自制）

為了增加一條探針同時標(biāo)記的熒光基團的數(shù)量,，研究人員采用了兩步雜交的策略。他們在設(shè)計探針時在特異性序列兩端加上了側(cè)翼序列,，側(cè)翼序列能與熒光基團標(biāo)記的讀出序列雜交,，使得一條探針上能夠同時結(jié)合兩個熒光基團。

（圖4：兩步雜交法,，圖片來源：參考文獻[1]）

熒光基團的組合不止有一種熒光基團,，研究人員設(shè)計探針時在同一條特異性靶向某種菌種的寡核苷酸序列兩端加上不同的讀出序列，使不同的讀出序列組合與特定的物種相對應(yīng),。又由于一條寡核苷酸探針上最多只能標(biāo)記兩種熒光基團,，為了實現(xiàn)在細菌中標(biāo)記多種熒光探針，研究人員利用了細菌體內(nèi)分布著大量的核糖體這一特性,，并且在實驗中研究人員也通過光子計數(shù)測量的方法估算出每個細菌中約有1000個核糖體,，保證多種靶向同一細菌的不同側(cè)翼修飾序列的探針能夠隨機、等比例地與細菌結(jié)合,。

（圖5：HiPR-FISH方法流程圖,，圖片來源：參考文獻[4]）

兩步雜交的過程可簡述為：

1.為每個目標(biāo)菌種合成一系列具有細菌特異性但讀出序列不同的探針，保證每一個細菌有唯一的讀出序列組合

2.使用經(jīng)過DNA側(cè)翼序列修飾的菌群特異性探針進行雜交

3.使用熒光標(biāo)記的讀出探針與側(cè)翼序列結(jié)合

4.光譜成像,，產(chǎn)生唯一的光譜圖

在光譜成像時,，研究人員使用五個波長的激光器同時單輪成像，通過激光共聚焦顯微鏡在五分鐘內(nèi)實現(xiàn)單個視野的拍照,。不同熒光基團同時成像得到的光譜圖是不同讀出探針的波峰疊加形成的波譜圖,。例如有R1和R2兩種讀出探針，最后得到的光譜圖是R1和R2讀出序列形成的波峰組合出獨特的波譜,。

（圖6：熒光基團發(fā)射光譜,，圖片來源：文獻截圖）

獲得光譜之后，通過統(tǒng)一流形近似與投射的降維技術(shù),，獲得一組主變量來減少所考慮的隨機變量數(shù)量,，實現(xiàn)數(shù)據(jù)可視化。再使用支持向量機這種學(xué)習(xí)算法，對數(shù)據(jù)分類和回歸,，解析出光譜對應(yīng)的二進制代碼,，獲取菌群的譜系信息。

（圖7：光譜解析,，圖片來源：文獻截圖以及自制）

為了進一步研究菌群的空間分布情況,，研究人員開發(fā)了一種區(qū)域臨界增強(LNE:local neighbourhood enhancement)的算法，LNE利用像素的局部鄰域信息將每個像素作為單元或背景的一部分進行分類,，對細菌邊界進行分割,，增加復(fù)雜菌群成像中單個細菌的分辨率。

（圖8：區(qū)域臨界增強算法,，圖片來源：文獻截圖）

技術(shù)流程

高譜系分辨熒光原位雜交技術(shù)的實驗流程為對復(fù)雜菌群樣本進行16S PCR擴增測序,，通過測序結(jié)果設(shè)計并合成探針，隨后將固定的樣本與探針特異性雜交,，再與讀出序列雜交,，光譜成像，最終對成像結(jié)果進行定量分析,，獲得細菌形態(tài),、大小以及空間分布等信息。

（圖9：HiPR-FISH實驗流程,，圖片來源：文獻截圖）

結(jié)果

Results

研究人員首先給算法創(chuàng)造一個訓(xùn)練集,，保證算法能夠根據(jù)訓(xùn)練集獲取的數(shù)據(jù)正確地預(yù)測實驗樣本中不同菌群的分類情況以及空間分布信息。研究人員對大腸桿菌標(biāo)記了1023個不同的條形碼（圖10:b,c）,，創(chuàng)建所有條形碼菌株在相同濃度下的混合物,，隨后進行成像（圖10:d），并對總共65,534個細胞進行了條形碼解碼,。該分類器提取實驗測量光譜的均值和協(xié)方差,，利用多變量正態(tài)分布模擬參考光譜（圖11:e）。后續(xù)實驗中對于復(fù)雜菌群的光譜解析均參照訓(xùn)練集模擬出的參考光譜,。

（圖10：大腸桿菌光譜成像,，圖片來源：文獻截圖）

隨后研究人員對這1023個標(biāo)記不同條形碼的大腸桿菌隨機分組，并測量了每組的單細胞光譜,，量化了每種混合物中不同條形碼的相對豐度,，最后發(fā)現(xiàn)，所有組的測量豐度和輸入豐度非常接近,，中位數(shù)斜率為0.95,，平均R²為0.83(圖11:f)。

在大腸桿菌中驗證了方法的可行性之后,，研究人員對11種細菌進行了探針設(shè)計和成像,。同時,，他們生成了最簡單、最復(fù)雜和隨機選擇的ABC三組探針,，讀出序列組合由更多的熒光團組成被認為是更復(fù)雜的,。每組探針靶向菌群中11個物種的特異性雜交序列是一樣的，只是側(cè)翼編碼的序列不同,。為了評估每個定制的物種特異性探針的特異性,，研究人員記錄了每個探針與物種組合的單細胞光譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)最簡單,、最復(fù)雜和隨機選擇的條形碼物種組合的指定條形碼和預(yù)期條形碼之間有很強的一致性（圖11:g）,。至此研究人員表示他們發(fā)現(xiàn)使用HiPR-FISH可以實現(xiàn)菌種特異性檢測和靈活的二進制編碼。

（圖11：HiPR-FISH方法驗證,，圖片來源：文獻截圖）

抗生素處理小鼠腸道菌群空間分布研究

接下來研究人員使用HiPR-FISH在人體復(fù)雜菌群中研究菌群的空間分布情況,。抗生素治療對黏膜相關(guān)腸道微生物組空間組織的影響尚未得到詳細研究,，于是研究人員首先在有無抗生素治療的情況下繪制了小鼠腸道微生物組的HiPR-FISH圖譜(圖12:c),。研究人員設(shè)計了兩組探針，包括115和264個探針,，靶向47個屬，并再次使用這些探針集來測試HiPR-FISH的可靠性,。研究人員比較了多個視野和不同組織切片的每個條形碼測量的熒光強度,，發(fā)現(xiàn)所有條形碼測量的總強度之間存在很強的相關(guān)性，這表明探針雜交和成像是可重復(fù)的,。接下來,，研究人員將HiPR-FISH成像結(jié)果與同一蠟塊包埋的組織的宏基因組測序結(jié)果進行比較，發(fā)現(xiàn)成像和測序測量結(jié)果一致,。

在使用克林霉素處理的小鼠結(jié)腸中,，研究人員從空間定位圖譜中解析出Bacteroides, Macellibacteroides 和 Longibaculum,實現(xiàn)了復(fù)雜菌群成像中單個菌種的定位。并計算了腸道中兩個常見菌屬擬桿菌屬和毛螺菌屬的徑向分布函數(shù)（PCF: pair correlation function）,，實驗結(jié)果表明擬桿菌PCF緩慢衰減,，表明擬桿菌在近距離(3.3μm左右)形成簇狀(圖12:d)。而helellia的PCF保持不變,，表明毛螺菌是隨機分布的,。接下來研究人員測量了細菌到粘膜邊界的距離，與之前觀察結(jié)果一致的是擬桿菌在粘膜邊界附近富集(圖12:e),。研究人員也對糞球末端區(qū)域進行了大面積平鋪掃描,，發(fā)現(xiàn)糞球表面覆蓋著一層致密的微生物(圖12:f)，即使在與宿主上皮組織沒有明顯接觸的位置也是如此,。最后,，他們生成了z-stack的體積渲染圖像(圖12:g),。

（圖12：克林霉素處理小鼠結(jié)腸菌群成像，圖片來源：文獻截圖）

接下來,，研究人員檢查了在環(huán)丙沙星處理后,，任何兩個類群之間的物種豐度和物理接觸數(shù)量的變化(圖13:a)。實驗結(jié)果表明擬桿菌門(Bacteroidetes) /厚壁菌門(Firmicutes)與對照組小鼠比較的比率增加(圖13:b),，這與之前研究一致,。與環(huán)丙沙星處理相關(guān)的Shannon多樣性有小幅但顯著的增加(獨立t檢驗，雙尾P = 0.002)(圖13:c),。環(huán)丙沙星處理小鼠和對照組小鼠的細胞小斑塊β-多樣性隨著斑塊大小的增加而減少(圖13:d),。為了檢查局部成分的變化，研究人員計算了小塊細胞之間的Bray-Curtis差異,。Bray-Curtis不相似性隨斑塊中心距離的增加而增加,，但在較大距離時仍然很小(圖13:e,f)。

（圖13：環(huán)丙沙星處理小鼠結(jié)腸菌群成像,，圖片來源：文獻截圖）

人類口腔微生物群空間分布研究

口腔微生物群是存在于人類的最多樣化的微生物群之一,，包括600多種普遍存在的菌種。研究人員在27個月的過程中,，對健康供體在7個時間點收集的菌斑生物膜進行HiPR-FISH(圖14:a).首先使用HiPR-FISH流程,，設(shè)計了靶向54個菌屬，由233個探針組成的探針組合,。在成像結(jié)果中觀察到與之前的觀察結(jié)果一致的,，由鏈球菌組成的玉米芯狀結(jié)構(gòu)(圖14:c)?？谇簧锬ぶ械奈⑸锶郝渌坪醣刃∈竽c道中的微生物群落更具空間結(jié)構(gòu)(圖14:b),。我們在縱向樣本中觀察到具有顯著形態(tài)的周期性微架構(gòu)，如Lautropia細胞簇(圖14:d),，這表明口腔微生物組的空間結(jié)構(gòu)隨時間保持穩(wěn)定,。為了更詳細地研究這一點，研究人員測量了細胞斑塊間的Shannon多樣性和Bray Curtis差異作為時間函數(shù),，發(fā)現(xiàn)兩者在縱向上是穩(wěn)定的(圖14:e, f),。口腔微生物組的Bray Curtis差異性高于小鼠腸道微生物組的Bray Curtis差異性,，支持視覺評價,，口腔微生物組比腸道微生物組更有空間組織。β-多樣性也遵循類似的趨勢(圖14:g),。為了檢驗不同微生物類群間空間相互作用的縱向穩(wěn)定性,，研究人員計算了每個時間點的聚合空間鄰接矩陣，并確定了Frobenius矩陣距離作為網(wǎng)絡(luò)相似性的度量,。在所有時間點測量的空間關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)比具有相同類群豐度的隨機網(wǎng)絡(luò)更相似,，再次表明口腔微生物群落結(jié)構(gòu)隨著時間的推移是穩(wěn)定的(圖14:h),。

（圖14：人體口腔菌苔菌群成像，圖片來源：文獻截圖）

接下來,，研究人員進一步關(guān)注了之前沒有原位環(huán)境中可視化微生物群落和感興趣的菌種,。他們發(fā)現(xiàn)了一個由假丙酸桿菌、心桿菌和Schwartzia組成的健康口腔微生物群（圖15:i）,。以及之前沒有被定位研究的菌屬,，Lachnoanerobaculum與以往研究報道的形狀相同，并且從Lachnoanerobaculum 和 Prevotellamassila的位置關(guān)系可以推測它們可能具有代謝相關(guān)性（圖15:j）,。最后通過將HiPR-FISH與超分辨率成像結(jié)合起來,，將系統(tǒng)發(fā)育信息與核糖體組織聯(lián)系起來，揭示了口腔微生物組中不同類群所表現(xiàn)出的細胞內(nèi)核糖體組織的不同策略（圖15:k）,。

（圖15：人體口腔菌苔未知菌群成像,，圖片來源：文獻截圖）

討論

Discussion

在本研究中，研究人員介紹了一種繪制復(fù)雜菌群空間分布圖譜的多功能工具HiPR-FISH.與現(xiàn)有的方法相比,，HiPR-FISH在鑒定菌種數(shù)量方面提高了十倍以上,。HiPR-FISH使用了一種以前被用來在組織中空間繪制mRNA分子圖譜的兩步雜交方案[5]。這種策略,，結(jié)合在微生物細胞中高豐度和相對均勻分布的16S rRNA分子,，使標(biāo)記細菌細胞的組合多達10個熒光團。HiPR-FISH在商用共聚焦顯微鏡上只需要一次成像,。單個視野可以在5分鐘內(nèi)成像,，比依靠連續(xù)雜交和成像的FISH程序更快。

HiPR-FISH能夠應(yīng)用于需要快速獲取數(shù)據(jù)的項目,，如可用于診斷傳染病。HiPR-FISH可為研究腸道,、口腔或植入設(shè)備上的復(fù)雜微生物種群開辟道路,；也可用于研究腸道相關(guān)疾病，如炎癥性腸道疾病,。此外,，HiPR-FISH將有助于分析微生物群在上皮屏障表面形成的腫瘤(如結(jié)直腸癌)的起始和進展中的作用。最后,，HiPR-FISH的定量單細胞測量將是測試軟物質(zhì)理論的有用資源,，這些理論控制著微生物群落的組合。

參考文獻

1.       Nguyen, J. and C. Tropini, Bacterial species singled out from a diverse crowd. Nature, 2020. 588(7839): p. 591-592.

2.       Valm, A.M., et al., Systems-level analysis of microbial community organization through combinatorial labeling and spectral imaging. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011. 108(10): p. 4152-7.

3.       Shi, H., et al., Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. Nature, 2020. 588(7839): p. 676-681.

4.       Shi, H., et al., Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities. 2020. 588(7839): p. 676-681.

5.       Moffitt, J.R. and X. Zhuang, RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence In Situ Hybridization (MERFISH). Methods Enzymol, 2016. 572: p. 1-49.