腫瘤研究|從組織處理,、培養(yǎng)到鑒定分析

ypgao 2020-11-25

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那么在對腫瘤細胞的研究中,，我們最常遇到的難題包括哪些呢？首先從腫瘤組織中獲得細胞的第一步就是制備單細胞懸液,，目前一般使用消化酶來消化腫瘤組織,。其中包括消化酶的選擇,、消化的時間,、是否需要去除紅細胞等都是在實驗操作中值得我們注意的地方。其次,，在進行細胞系培養(yǎng)的過程中,，如何培養(yǎng)出更具有生理相關性的腫瘤細胞才能更好地達到我們的研究目的？除此之外,，怎樣鑒定我們得到的細胞是目的腫瘤細胞呢,？針對這些問題,，今天這一期推文我們來具體聊一聊。

從腫瘤組織制備單細胞懸液

下述操作步驟適用于乳腺癌（4T1）,、黑色素瘤（B16-F10）和結腸癌（CT26.WT）的小鼠模型的實體瘤或人乳腺癌和卵巢癌組織,。若您使用的是其它腫瘤組織，消化步驟需進一步優(yōu)化,，詳情請咨詢我們的技術支持,。

實驗步驟

該步驟中所用的試劑體積適用于處理少于1.0g的腫瘤組織。若您需要處理大于1.0g的腫瘤組織,，請適當調(diào)整體積,。

1. 混合以下試劑，以制備5 mL的腫瘤組織消化液：

- 500 μL膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液（產(chǎn)品號 #07912）

- 750 μL DNase I溶液（1 mg/mL,；產(chǎn)品號 #07900）

- 3.75 mL RPMI 1640培養(yǎng)基（產(chǎn)品號 #36750）

充分混勻并預熱至室溫（15 - 25°C）,；

2. 將腫瘤組織收集到35 mm培養(yǎng)皿（產(chǎn)品號 #27100）中，用剪刀或手術刀將腫瘤組織切碎成小塊（≤ 2 mm）,；

3. 將剪碎的腫瘤組織轉(zhuǎn)移至14 mL圓底管（產(chǎn)品號 #38008）,，并加入步驟1中混勻的消化液；

4. 在37°C搖床,，90 rpm,，孵育25分鐘；

5. 將70 μm細胞過濾器（產(chǎn)品號 #27260）置于50 mL無菌錐形管（產(chǎn)品號 #38010）上,，并使用推薦溶液（EasySep?緩沖液,，產(chǎn)品號 #20144，或含2%FBS和1 mM EDTA的PBS,。注意溶液不含Ca 和Mg ）潤洗濾網(wǎng),；

6. 將4中充分孵育的腫瘤組織混合液從培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至潤洗過的70 μm細胞過濾器，使用無菌注射器的活塞/柱塞,，以溫和畫圓的方式使細胞和組織通過濾網(wǎng),。接著使用推薦溶液沖洗濾網(wǎng)并將其收集至同一錐形管中，最后使用推薦溶液將錐形管中溶液體積補充至50 mL,；

7. 室溫下300 x g,，離心10分鐘，小心去除上清液,；

注意：離心過程中將離心機設置為緩慢加速和減速,。

8. 在收集的細胞中加入10 mL氯化銨溶液（產(chǎn)品號 #07800），室溫下孵育5分鐘,；

注意：此步驟是為了去除紅細胞,。對于一些無需去除紅細胞的腫瘤組織，可忽略8,、9步驟,。

9. 加入推薦溶液至50 mL,，室溫下300 x g，離心10分鐘,，小心去除上清液,；

注意：離心過程中將離心機設置為緩慢加速和減速。

10. 對于人的腫瘤組織,，將細胞按1 x 10^8 cells/mL的濃度重懸于推薦溶液中,；對于小鼠的腫瘤組織，將細胞按5 x 10^7 cells/mL的濃度重懸于推薦溶液中,。

注意：若需要從小鼠腫瘤中獲得更高純度的TIL,，可將細胞按5-10 x 10^7 cells/mL濃度重懸；若需要獲得更多的TIL,，即回收率更高,，可按1-2.5 x 10^7 cells/mL濃度進行重懸。

腫瘤細胞的培養(yǎng)

傳統(tǒng)的2D貼壁細胞培養(yǎng)模型由于缺乏體內(nèi)組織微環(huán)境導致細胞結構與體內(nèi)存在顯著差異,，從而導致藥物響應模式及信號分子通路的表達與生物體內(nèi)顯著不同,。而3D細胞腫瘤球可以通過模擬三維細胞網(wǎng)絡、細胞與基質(zhì),、細胞與細胞之間的相互作用,，更貼近腫瘤組織相應的病理生理特征。目前3D腫瘤球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應用于腫瘤細胞的培養(yǎng)和分化,、癌癥研究,、藥物和毒性篩選等特定應用中。

STEMCELL的AggreWell?培養(yǎng)板（產(chǎn)品號 #34460）即可進行細胞的3D培養(yǎng),，通過它可輕松生成大小均一的3D腫瘤球（圖1）,，并且適用于多種腫瘤細胞類型，包括乳腺癌[1],，前列腺癌[2],，結腸癌[2]，肝癌[3,4],，小膠質(zhì)細胞瘤細胞系[5]等,。

圖1. 使用AggreWell?生成的腫瘤球大小、形態(tài)均一

（A）結腸癌細胞系HT29（B）前列腺癌細胞系LNCap（C）食管癌細胞系TE6,。所有細胞球都按每微孔100個細胞的密度鋪板,。放大倍數(shù)為10X。圖片由卡爾加里大學的Golsa Razian和Mark Ungrin友情提供,。

腫瘤干細胞的鑒定

腫瘤干細胞（Cancer Stem Cell, CSC）是一種獨特的腫瘤細胞亞群,，具有類似干細胞的自我更新、多能分化和無限增殖的能力,。CSCs已被廣泛認為是癌癥進展,、復發(fā)、治療耐藥以及轉(zhuǎn)移的原因,。不同腫瘤的CSC具有不同的表面標志物,，比如CD133 、CD44 CD24-等[6],。此外,，還可以用檢測細胞內(nèi)乙醛脫氫酶（ALDH）活性的方法來檢測腫瘤干細胞。

ALDH的活性已經(jīng)被證實在多種組織中可以作為具有干細胞特性的惡性細胞的有用標志物,。在多發(fā)性骨髓瘤和急性髓細胞白血?。ˋML）[7-9]、前列腺癌[10],、結腸癌[11,12],、頭頸癌[13,14]、甲狀腺癌[15],、乳腺癌[16-18],、肝癌[19]、卵巢癌[20],、宮頸癌[21],、膀胱癌[22]、腦癌[23]和肺癌[24]中,，都發(fā)現(xiàn)了ALDH的表達增加,。也有研究顯示，ALDH表型與多種癌癥的不良預后結果有關[18,25,26],。ALDH的活性是通過ALDEFLUOR?（產(chǎn)品號 #01700）,，一種非免疫的熒光試劑來檢測的，已被超過1000篇文獻所引用,。查看以下視頻,，了解ALDEFLUOR?檢測腫瘤干細胞的技術原理。