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做細(xì)胞研究,，怎么能不會(huì)線粒體？ 線粒體（Mitochondrion）是一種存在于大多數(shù)細(xì)胞中的由兩層膜包被的細(xì)胞器,，是細(xì)胞中制造能量的結(jié)構(gòu),，是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所。 活細(xì)胞中線粒體存在融合和裂變的動(dòng)態(tài)循環(huán)穩(wěn)態(tài),，研究表明,，融合和裂變的平衡直接影響線粒體網(wǎng)絡(luò)形態(tài)并由此影響ATP穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞功能，在細(xì)胞的生理和病理過程中扮演了十分重要的角色,。 目前最常見的線粒體形態(tài)檢測(cè)方法包括電鏡法和共聚焦顯微鏡法,，電鏡只能獲取靜態(tài)圖像，而共聚焦顯微鏡由于其優(yōu)秀的動(dòng)態(tài)檢測(cè)能力,，在線粒體網(wǎng)絡(luò)研究中得到了更廣泛的應(yīng)用,。 那么如何對(duì)線粒體進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析？目前大部分線粒體分析軟件均為商用軟件,，已有的免費(fèi)軟件很難分析比較厚的細(xì)胞或存在密集線粒體網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞（如胰島β細(xì)胞）,。 今天半夏給大家分享基于美國(guó)NIH開發(fā)的ImageJ軟件進(jìn)行線粒體形態(tài)學(xué)分析。ImageJ（https://imagej./ij/）是美國(guó)NIH開發(fā)的免費(fèi)開源圖像處理軟件,，廣泛的應(yīng)用于生物,、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。 Fiji是已經(jīng)預(yù)裝了諸多生物醫(yī)學(xué)分析的常用插件的ImageJ,，其下載鏈接為：https:///Fiji/Downloads,。 
Mitochondria Analyzer分析線粒體網(wǎng)絡(luò)
Mitochondria Analyzer插件將3D ImageJ Suite、ImageScience,、IJPB-Plugins（MorphoLibJ）等插件聯(lián)用,，可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜線粒體網(wǎng)絡(luò)的2D、2D時(shí)間序列(xyt),，3D和4D(xyzt)圖像分析；同時(shí)還支持多通道的同時(shí)分析【1】,。 1. Mitochondria Analyzer插件安裝方法 Mitochondria Analyzer要求ImageJ 1.52版本或以上,，且只能在Windows中運(yùn)行，目前沒有Mac OS版本,。 可以通過以下方式安裝Mitochondria Analyzer及所有分析所需插件： ImageJ主界面 -> help -> Update,，打開ImageJ Updater主界面,，點(diǎn)擊Manage Update Sites： 勾選以下站點(diǎn)：a. 3D ImageJ Suite；b. ImageScience ,；c. IJPB-Plugins,。點(diǎn)擊Add Update Site，在Name中輸入Mitochondria Analyzer,，在URL中輸入http://sites./ACMito/,，依次點(diǎn)擊Close -> Apply Changes： 重啟ImageJ/FiJi，檢查下載的文件是否在Update文件夾中,，如果在,，將其轉(zhuǎn)移到Plugins文件夾中，完成安裝,。 2. Mitochondria Analyzer分析流程Mitochondria Analyzer 2D和3D線粒體分析的總體流程如下：高質(zhì)量的圖像采集對(duì)于Mitochondria Analyzer線粒體網(wǎng)絡(luò)的精確分析很重要,，對(duì)于3D圖像，最好采用最佳奈奎斯特采樣率（https:///NyquistCalculator）進(jìn)行采樣并通過相關(guān)軟件去卷積（deconvolved）,，這將有助于提高3D重建和分析的準(zhǔn)確性,。去卷積軟件包括Huygens Professional、ImageJ/Fiji插件DeconvolutionLab2等,。3D圖像?？梢酝ㄟ^“3D Viewer” or “Volume Viewer”進(jìn)行查看。① 線粒體形態(tài)分析之前需要對(duì)圖像進(jìn)行預(yù)處理,，并設(shè)定合適的閾值,，以將圖像中的線粒體與背景區(qū)分開并精確的識(shí)別出來；此外,，如果為疊加多通道圖像,，需拆分單通道，Image -> Color -> Split Channels,，并將單通道圖像轉(zhuǎn)化為8-bit格式,。此外還需要將像素單位改為微米Image -> Properties。② 在ImageJ/FiJi主菜單中點(diǎn)擊Plugins -> Mitochondria Analyzer -> Analyzer manager,，打開Mitochondria Analyzer的操作主界面：③ 點(diǎn)擊進(jìn)入2D Threshold Optimize,，可以看到閾值設(shè)定和圖像處理過程包含以下步驟：預(yù)處理、閾值優(yōu)化,、后處理,。預(yù)處理包括“Subtract Background”,“Sigma Filter Plus”,“Enhance Local Contrast”和“Gamma Correction”。后處理包括“Despeckle”,“Remove Outliers”與“Fill 3D Holes”：需要注意的是,，針對(duì)不同的實(shí)驗(yàn)和圖像采集條件,，閾值需進(jìn)行一定的優(yōu)化，以獲得最準(zhǔn)確的結(jié)果,。一個(gè)理想的閾值應(yīng)當(dāng)忠實(shí)地捕捉原始圖像中線粒體信號(hào)的形態(tài),，并應(yīng)避免合并緊密相鄰但物理上分離的線粒體,，或分裂單個(gè)線粒體。閾值有全局（Global）閾值和局部(Adaptive)閾值兩種類型,，如下圖所示,，一般來講局部閾值更準(zhǔn)確一些。Mitochondria Analyzer采用的是局部閾值,，局部閾值會(huì)計(jì)算圖像中的每一個(gè)像素的閾值,，包括均值（Mean）、中值（Median）,、中灰度值（MidGrey）和加權(quán)平均法（Weighted Mean）四種算法,，通常一般來講Mean和Weighted Mean算法可以獲得更加精確的結(jié)果：此外，需要對(duì)閾值的兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化：Block size和C-value,。Block size決定了計(jì)算每個(gè)像素閾值時(shí)所包含的周圍像素的范圍,，其大小一般與想要分析的對(duì)象（如線粒體）大小相關(guān)。C-values提供閾值校正,，有助于在最小化背景信號(hào)與不正確地將單個(gè)線粒體分割成多個(gè)小片段之間取得平衡,。在Threshold Optimize中設(shè)定初始Block size和C-value，點(diǎn)擊OK,，可以自動(dòng)生成各閾值條件下的閾值處理結(jié)果,，通過與原始圖像進(jìn)行比較，以確定最佳閾值組合,。需要注意的是,，這里生成的圖像棧的前處理和后處理的各項(xiàng)參數(shù)是相同的。確定最佳參數(shù)組合后,，點(diǎn)擊進(jìn)入2D Threshold或3D Threshold,，對(duì)圖像進(jìn)行閾值化處理，以獲得二值化圖像,。將上一步獲得二值化圖像用于線粒體形態(tài)和網(wǎng)絡(luò)分析,，Mitochondria Analyzer -> 2D Analysis：對(duì)于2D圖像參數(shù)結(jié)果包括用以描述線粒體大小的線粒體面積(area)和周長(zhǎng)(perimeter),以及用以描述形態(tài)的外形因數(shù)(form factor)和縱橫比(aspect ratio)。描述線粒體網(wǎng)絡(luò)的參數(shù)包括網(wǎng)絡(luò)分支數(shù)（branches）,、分支長(zhǎng)度（branch lengths）,、分支連接（branch junctions）。對(duì)于3D圖像,，則通過體積（Volume）和表面積（Surface Area）描述線粒體大小,，球形率（Sphericity）描述線粒體形態(tài)。下圖為各項(xiàng)參數(shù)的詳細(xì)計(jì)算方式：下圖是線粒體熒光圖像進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析的具體例子,，可知Mitochondria Analyzer的各項(xiàng)參數(shù)可以準(zhǔn)確的反應(yīng)不同狀態(tài)的線粒體網(wǎng)絡(luò)：擴(kuò)展：ImageJ網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析神器Ridge (Line) Detection Plugin分析網(wǎng)絡(luò),，地址：https:///Ridge_Detection。下載ij_ridge_detect-1.4.0.jar插件后將文件置于plugins文件夾下,，重啟軟件即可,。Ridge (Line) Detection Plugin分析實(shí)例如下：該插件的使用非常簡(jiǎn)單，有興趣的小伙伴可自己去了解,！MA是一款基于NIH免費(fèi)開源軟件ImageJ開發(fā)的線粒體網(wǎng)絡(luò)分析插件,，通過圖像處理和線粒體識(shí)別，可以方便快捷地實(shí)現(xiàn)對(duì)2D和3D線粒體網(wǎng)絡(luò)的精確分析【2】,。MiNA包含一些可選的預(yù)處理步驟將原始線粒體圖像轉(zhuǎn)換為二值化圖像用于計(jì)算線粒體網(wǎng)絡(luò)參數(shù),，下載地址為：https://github.com/ScienceToolkit/MiNA。打開鏈接,，點(diǎn)擊Clone or download下載MiNA,。
安裝MiNA宏，打開FIJI,，點(diǎn)擊Plugins -> Macros -> Install,，選擇MiNA-master中src下的MiNA.ijm文件，在Plugins -> Macros即可看見已經(jīng)安裝成功的宏,。MiNA工作流程圖對(duì)應(yīng)具體線粒體圖片舉例：細(xì)胞中的線粒體存在兩種類型的結(jié)構(gòu)：線粒體網(wǎng)絡(luò)（Networks）和單獨(dú)個(gè)體（Individuals）,。下圖為線粒體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖解：沒有分支連接且分支長(zhǎng)度最小的點(diǎn)狀對(duì)象（單獨(dú)個(gè)體）(左)；沒有分支連接但分支長(zhǎng)度較高的長(zhǎng)的單管狀個(gè)體(中),；以及具有多個(gè)分支和連接的復(fù)雜對(duì)象(灰點(diǎn)),。下面以一個(gè)典型的不同形態(tài)的線粒體形態(tài)為例進(jìn)行分析方法介紹，從左到右簡(jiǎn)化形態(tài)依次是點(diǎn)狀,、管狀和線粒體網(wǎng)絡(luò)：打開FIJI,依照前述方法在Plugins -> Macros中安裝NiNA,。打開示例圖片： 點(diǎn)擊Plugins -> Macros -> MiNA -> Analyze Mitochondrial Morphology。將出現(xiàn)以下提示界面： Processing to Apply下有CLAHE,Median Filter和Unsharp Mask三個(gè)可選擇的預(yù)處理選項(xiàng),，默認(rèn)情況下不選擇任何選項(xiàng),。參考MiNA工作流程可知預(yù)處理有助于骨架結(jié)構(gòu)更接近視覺上看見的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，同時(shí)這也會(huì)引入一定的偏差,，因此需要謹(jǐn)慎使用,，具體根據(jù)分析出的實(shí)際效果而定。點(diǎn)擊OK,開始分析,。得到結(jié)果：NiNA Output可以得到諸多結(jié)果：可知單獨(dú)個(gè)體線粒體結(jié)構(gòu)（Individuals）有2個(gè),，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（Networks）有1個(gè)。平均分支長(zhǎng)度（Mean Branch Length）為6.529μm,，分支長(zhǎng)度的中位數(shù)（Median Branch Length）為6.936μm,。長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)偏差（Length Standard Deviation）為4.557μm。關(guān)于中位數(shù)和平均值,，中位數(shù)是以統(tǒng)計(jì)的最大和最小值中間那個(gè)值,，比如最小1，最大10中間值是5.5.平均值則是所有測(cè)量結(jié)果全部加起來去平均,。比如有5個(gè)數(shù),，1,，3，7,，9,，10，平均值是6,，而中位數(shù)是5.5,。還可得到平均網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的大小（Mean Network Size）,，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)大小的中位數(shù)（Median Network Size）,，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)大小的標(biāo)準(zhǔn)偏差（Network Size Standard Deviation）以及線粒體足（Mitochondrial Footprint）的長(zhǎng)度。今天半夏給大家分享ImageJ進(jìn)行線粒體形態(tài)學(xué)分析就到此為止了,，希望對(duì)大家有所幫助,！感興趣的小伙伴趕緊去嘗試嘗試吧。Chaudhry A, Shi R, Luciani DS. A pipeline for multidimensional confocal analysis of mitochondrial morphology, function, and dynamics in pancreatic β-cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2020;318(2):E87-E101. doi:10.1152/ajpendo.00457.2019Valente, A.J., et al., A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem, 2017. 119(3): p. 315-326.
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