紐約州立大學(xué)精神病學(xué)系教授Meyers等人在Molecular Psychiatry雜志發(fā)表非洲血統(tǒng)家族中酒精依賴的內(nèi)表型研究,?？焖?/span>beta節(jié)律（20-28Hz，以下簡稱beta）EEG振蕩活動可能是研究神經(jīng)超興奮性(neuralhyperexcitability)疾病的遺傳學(xué)有用的內(nèi)表型(endophenotype),，包括物質(zhì)使用障礙（substance use disorders, SUDs）,。然而，目前還未對非裔美國人血統(tǒng)（African-American ancestry,AA）的EEGβ節(jié)律的遺傳基礎(chǔ)進(jìn)行研究,。因此,，該研究的第一目標(biāo)：從酒精中毒遺傳學(xué)合作研究（The Collaborative Study on the Genetics of Alcoholism, COGA）中挑選AA家庭，做beta節(jié)律（發(fā)生于雙側(cè)枕葉,，前人研究中發(fā)現(xiàn)此節(jié)律具有高度的遺傳性）的全基因組關(guān)聯(lián)研究（Genome-wideassociation study, GWAS）,，這些AA家庭是最近確定的受到酒精依賴（AlcoholDependence, AD）和共同發(fā)生的外化障礙（externalizingdisorders，例如,，SUD,ADHD）影響的家庭樣本,。第二個目標(biāo)：探索GWAS發(fā)現(xiàn)的功能和行為學(xué)意義。

人類的腦生理振蕩分為不同的頻帶（delta(1-3 Hz), theta (4-7 Hz), alpha (8-12 Hz), beta (13-28 Hz)和gamma(>29 Hz)）,，每一頻帶反映了不同的全腦狀態(tài)（例如,，alpha反映了放松狀態(tài)，而beta反映了警覺狀態(tài)）,。有研究發(fā)現(xiàn),，beta與幾種外化障礙有關(guān)（如，AD,SUDs, ADHD）,。鑒于此以及以往在雙生子研究中發(fā)現(xiàn)的beta的高度遺傳性,，研究者認(rèn)為，beta是一個有用的內(nèi)表型,，用于識別個體這些障礙的潛在遺傳因素,。

之前有研究報(bào)告了酒精使用障礙（alcoholuse disorders，AUD）的beta（>19Hz）能量存在差異,。此外,，beta不受疾病嚴(yán)重程度的影響,。由于酗酒者的后代在危險飲酒開始之前就存在升高的beta，因此,，研究者假設(shè),，過高的beta功率是先于AUD的發(fā)展，而且,，與發(fā)展為AUD的潛在遺傳傾向是相關(guān)的,，即beta可能是大量飲酒的原因，而不是大量飲酒的結(jié)果,。Begleiter和Porjesz認(rèn)為beta可能是大腦皮層興奮-抑制失衡的電生理指標(biāo),，而這容易發(fā)展為AUD。進(jìn)一步支持這一假設(shè)的是beta與其他障礙的關(guān)聯(lián),，如行為障礙,，兒童、青少年的外化障礙,，ADHD,，網(wǎng)絡(luò)成癮等。

盡管雙生子和家族研究發(fā)現(xiàn)了beta的高遺傳性（49-85%）,，但鮮有遺傳學(xué)對此進(jìn)行研究,，目前，僅有一項(xiàng)發(fā)現(xiàn)得到重復(fù),。重要的是,，對AA群體還沒有進(jìn)行EEG的GWAS，因此在AA群體中還沒有很好地描述EEG的相關(guān)性特征的遺傳結(jié)構(gòu),。在AA群體中進(jìn)行遺傳學(xué)研究除了考慮到公共衛(wèi)生重要性之外,，還因?yàn)榧膊〉任换蝾l率和連鎖不平衡模式存在更大的遺傳多樣性和進(jìn)化差異性。此外,，AA飲酒者要經(jīng)歷更多與酒精有關(guān)的問題,，包括社交問題，疾病和死亡,，這說明需要識別減輕導(dǎo)致問題飲酒風(fēng)險的因素,。因?yàn)檠芯炕镜拇竽X功能與人類的行為和障礙的關(guān)系的最終目標(biāo)是提供對所有人的預(yù)防和/或干預(yù)，這一問題的理論需要加以解決,。鑒于beta具有高度可遺傳的并且與幾種外化行為以及SUDs有關(guān),，beta的遺傳分析可能有助于我們理解有一系列外化障礙風(fēng)險的個體的腦功能。因此,，本研究的第一個目標(biāo)是對AA群體進(jìn)行EEG的beta節(jié)律的GWAS的研究,。第二個目標(biāo)是探索GWAS發(fā)現(xiàn)的功能和行為學(xué)意義。

該研究從COGA中選擇482組家庭中的2382個AA作為被試，對其EEG靜息態(tài)的beta節(jié)律進(jìn)行GWAS,。為進(jìn)一步描述基因發(fā)現(xiàn),，該研究探索了GWAS變異體的功能和臨床/行為意義。結(jié)果顯示位于染色體3q26的基因區(qū)間上的10個相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）（r²> 0.9）與beta節(jié)律相關(guān)（P < 5 × 10 ^{- 8}）,。最顯著相關(guān)的SNP是rs11720449（β= -0.124,，p<4.5×10^-9），也是丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase,BCHE）在丘腦組織中表達(dá)的數(shù)量性狀位點(diǎn),。10種中的4種全基因組SNPs與COGA的AA家庭的精神障礙酒精依賴診斷和統(tǒng)計(jì)結(jié)果有關(guān)聯(lián),，其中兩個（rs13093097，rs724372）已在獨(dú)立的AA被試中被重復(fù),。在AA青少年（來自COGA家庭的后代）的分析中表明,，rs11720469與重度飲酒（頻率為24h內(nèi)飲用5瓶酒以上）有關(guān)。該研究為3q26中的基因變異在神經(jīng)和行為抑制中的作用提供了支持,。這些新的基因發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了在基因研究中加入AA種群的重要性以及內(nèi)表型方法的效用，以增強(qiáng)我們對成癮易感性機(jī)制的了解,。

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 關(guān)于酒精中毒遺傳學(xué)的合作研究

參與者接受酒精中毒遺傳學(xué)的半結(jié)構(gòu)化評估（TheSemi-Structured Assessment for the Genetics of Alcoholism, SSAGA）,，這是一個多診斷性的訪談。年齡在18歲以下的個體接受青少年版的SSAGA,。還要收集他們的DNA和EEG,。從GWAS數(shù)據(jù)中提取的主成分（Principalcomponents, PCs）被用來在全基因分型樣本中分組為不同的祖先血統(tǒng)，同時也是選擇AA家庭的基礎(chǔ),。分析的樣本包括來自482個家庭的2382個個體（Table1）,，有99.5%的AA個體（通過PCs定義）自我定義為黑人/非裔美國人，其中27.6%符合AD標(biāo)準(zhǔn),，其他共同發(fā)生的藥物使用和外化障礙也是重要的標(biāo)準(zhǔn),，例如，可卡因依賴,，ADHD,。

   2.EEG記錄

記錄閉眼靜息EEG4.25 min，分析256s的連續(xù)時間段,。本研究主要關(guān)注的是分布在雙側(cè)枕葉上（O1-O2）,，經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換的絕對的beta節(jié)律（20-28Hz）的功率。

   3. 基因型,，歸因和質(zhì)量控制

使用Illumina2.5M陣列（Illlumina,San Diego, CA, USA）在遺傳疾病研究中心對598個家庭的3414個人進(jìn)行基因型分類,。基因分型率小于98%或違反 Hardy-Weinberg平衡（p < 10^-6）或次等位基因頻率（minorallele frequency,，MAF）<3的SNPs被排除,。不符合孟德爾（Mendelian）遺傳定律的數(shù)據(jù)被移除，使用SHAPEIT和IMPUTE2，數(shù)據(jù)被歸因到1000個基因組（hg19）,。接下來,，基因型概率 ≥ 0.9被改變?yōu)榛蛐汀８鶕?jù)Wetherill等人的描述,，在被分類的SNPs中,，Mendelian錯誤被重新估計(jì)和解決。歸因信息得分 < 0.3或MAF < 0.03的SNPs在隨后的分析中被刪除,。

     4.GWAS

使用線性混合模型對在GWAF（Genome-wideassociation analyses with family）中的12972748個SNPs進(jìn)行GWAS分析,，并且納入遺傳關(guān)聯(lián)矩陣（geneticrelatedness matrix）來控制家庭樣本中的親緣關(guān)系。因?yàn)樾詣e和經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換的年齡（EEG記錄時）都與β節(jié)律有關(guān)（p< 0.001）,，因此在模型中,，他們作為協(xié)變量存在。為進(jìn)一步減少由于群體分層導(dǎo)致的假陽性,，從SNPRelate計(jì)算得到的前10個PCs（PC1-PC10）也作為模型協(xié)變量,，假設(shè)了一個額外的遺傳模型。最后使用p< 5×10^-8表示為全基因組顯著性的閾限,。利用全基因組復(fù)雜性特征分析（Genome-widecomplex trait analysis, GCTA）確定樣本中β節(jié)律的SNP遺傳率,。將遺傳關(guān)聯(lián)矩陣納入家族聚類的遺傳估計(jì)中。

    5.     功能分析

在英國腦表達(dá)協(xié)會（UKBrain Expression Consortium,，BRAINEAC）中,，我們檢驗(yàn)了與beta節(jié)律最顯著關(guān)聯(lián)的變異體是否是一個表達(dá)的數(shù)量性狀基因座（expressionquantitative trait locus，eQTL）,。Braineac收集了來自134個歐洲血統(tǒng)的神經(jīng)病理學(xué)正常個體的數(shù)據(jù)（Table3）,，并對10個不同的腦區(qū)進(jìn)行評估。只有與β節(jié)律最相關(guān)的單個的SNP才在Braineac被分析從而使得多重測量達(dá)到最小化,，所有的p值都經(jīng)過Bonferonni矯正,。在Genotype-TissueExpression Project（GTEx）數(shù)據(jù)庫中，我們只分析了經(jīng)受住多次測量還達(dá)到顯著水平的遺傳-β關(guān)聯(lián),，以確定eQTL的發(fā)現(xiàn),。

    6.     飲酒行為

我們確定了與β相關(guān)的全基因組變異是否也與樣本（來自480個家庭中的2242人）中的DSM-IV AD（Diagnosticand Statistical Manual of Mental Disorders）相關(guān)。使用SAS9.4軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,。根據(jù)年齡,，性別，親緣關(guān)系和PC1-PC10對邏輯回歸模型進(jìn)行調(diào)整,。我們檢驗(yàn)了所有的β的與全基因組顯著的SNPs的相關(guān),。使用P_norm程序?qū)€體的p值進(jìn)行調(diào)整，這一程序包括SNPs的LD結(jié)構(gòu)（Linkagedisequilibrium patterns）和親屬的抽樣,。

接下來,，在不相關(guān)個體的獨(dú)立樣本中（被招募來研究阿片類,、可卡因或AD的基因，數(shù)據(jù)可在dbGaP上公開訪問）,，我們研究GWAS變異是否與DSM-IVAD相關(guān)聯(lián),。只有可以獲得AD數(shù)據(jù)的AA個體才被納入分析（1346個AD和461個控制組被試）。

最后,，實(shí)驗(yàn)要求參與者：“思考過去的12個月,，有多少次是在24小時內(nèi)喝5瓶或者5瓶以上的酒？”（白的嗎,？）,，選項(xiàng)從“從不”到“每天”。在212個家庭中892人中,，有33.8%的人曾經(jīng)喝過大量的酒,。剩余的66.2%是0。由于樣本量相對較少,，只分析與β最相關(guān)的SNP以最小化多重檢驗(yàn),。在Mplus7.4中，使用對數(shù)轉(zhuǎn)換后的重度飲酒者對此關(guān)聯(lián)進(jìn)行檢驗(yàn),，并根據(jù)親緣關(guān)系,、性別、年齡和PC1-PC10對模型進(jìn)行調(diào)整,。

   7.     事后檢驗(yàn)

先前研究發(fā)現(xiàn)BCHE（或周邊區(qū)域:3q26）與beta以及AUD（包括ADHD，可卡因使用問題）的行為學(xué)相關(guān)聯(lián),。為了確定3種障礙（DSM-IV,DSM-IV ADHD, DSM-IV CoD）各自是否可以解釋顯著的beta信號,，我們分別對3種疾病的beta的GWAS進(jìn)行了事后檢驗(yàn)，其中,，每種障礙作為模型的協(xié)變量,。

結(jié)果：

1.   beta節(jié)律的GWAS

位于3q26上的基因間隔區(qū)域（Chr3, 166 471 942–166 489 551）的10個SNPs（基于非洲血統(tǒng)中的hg191000基因組的所有10個SNPs成對相關(guān)r²> 0.9）與beta節(jié)律相關(guān)（p< 5×10^-8）（Table2，Figure 1,，Figure 2）,。最顯著的SNP是rs11720469（p< 4.5×10^-9），次要等位基因（G）與beta呈負(fù)相關(guān)（β= -0.124）,。圖2展示了GWAS信號以及已知基因上,、下游的信號，包括BCHE,PDCD10, WDR49, SERPINI1, SERPINI2和ZBBX,。GABRA2也與beta節(jié)律相關(guān),，但不是全基因組水平上（p< 0.01）。GCTA發(fā)現(xiàn),，在beta節(jié)律中,，有33.8%的變異（s.e.:0.014, p < 5.5×10^-17）是由于全基因組水平的SNPs（狹義遺傳率）造成的,。

    2.     功能分析

在Braineac數(shù)據(jù)庫中，rs11720469與BCHE,PDCD10, SERPINI1, WDR49和ZBBX的mRNA的表達(dá)相關(guān),。其中,，經(jīng)過Bonferroni矯正以后，只有一個結(jié)果依舊顯著：rs11720469是丘腦組織中BCHE表達(dá)的eQTL（p= 4.20×10^-4）,。次要等位基因與減少的mRNA表達(dá)有關(guān)（Table3）,。在GTEx數(shù)據(jù)庫中，rs11720469與腦組織中BCHE的表達(dá)有關(guān)：大腦皮層（p< 0.007）,，尾狀核（p< 0.005）,。HaploRegV4.1指出在ROADMAP表觀基因組學(xué)數(shù)據(jù)中，rs11720469改變了一些細(xì)胞的調(diào)控模式,。

  3.飲酒行為

在GWAS的子樣本中,，與beta節(jié)律相關(guān)的10個變異中的7個也與AD有關(guān)（Table4）；次要等位基因與減少的AD風(fēng)險有關(guān),，表示一定的保護(hù)作用,。考慮到在這10個SNPs中觀察到的高LD,，這些p值根據(jù)使用P_norm程序估計(jì)的測試數(shù)量（1.2）進(jìn)行調(diào)整,，其中4個變異經(jīng)過多重矯正后差異依然存在：rs7428372（β：-0.164，p < 0.037）,，rs11705903（β：-0.161,，p< 0.039），rs6806557（β：-0.161,，p< 0.041）,，rs13093097（β：-0.172，p< 0.027）,。

在獨(dú)立樣本中,，10個SNPs中的4個與AD有關(guān)（Table4）。經(jīng)過多重比較矯正后,，其中2個SNPs的相關(guān)依然存在：rs7428372（β：-0.167,，p< 0.042），rs13093097（β：-0.179,，p< 0.029）,，次要等位基因與減少的AD風(fēng)險有關(guān)，表示著保護(hù)作用,。

最后,，來自COGA家庭的青少年/年輕成人的AA子樣本，有一個或多個次要等位基因的副本與重度飲酒的減少有關(guān)（β：-0.064,，p < 0.035）,，但是效應(yīng)量不大,。

   4.     事后比較分析

在主要的GWAS樣本中，beta能量越高的個體越可能符合DSM-IVAD, CoD和ADHD標(biāo)準(zhǔn)（all p < 0.001,，Bonferroni矯正）,。為確定其中一種疾病是否可以解釋beta中觀測到的顯著信號，我們分別進(jìn)行了3種障礙的beta節(jié)律的GWAS的事后檢驗(yàn),，每一檢驗(yàn)都將這些基因型之一作為協(xié)變量,。AD作為協(xié)變量，3q26與beta的相關(guān)仍存在,，但有些降低（rs11720469：β：-0.12,，p：2.2×10^-8）,。DSM-IVCoD作為協(xié)變量,，相關(guān)性仍在，但是有輕微減少（rs11720469：β：-0.122,，p：1.3*10^-8）,。DSM-IV ADHD作為協(xié)變量,，相關(guān)性減少（rs11720469：β：-0.088，p：6*10^-4）,。

結(jié)論：

這項(xiàng)研究是在AA樣本中進(jìn)行的,，位于3q26的基因間隔區(qū)間上的信號與beta節(jié)律存在關(guān)聯(lián)。最顯著的SNP是一種BCHE的eQTL,，它是一種與抑制障礙有關(guān)并在丘腦中表達(dá)的基因,，丘腦是大腦中beta節(jié)律和AUD的核心腦區(qū)。此外,，在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的樣本和獨(dú)立樣本中,，beta節(jié)律全基因組相關(guān)的變異（rs7428372和rs13093097）與AD有關(guān)聯(lián)。這些證據(jù)為3q26內(nèi)的遺傳變異在神經(jīng)超興奮性和以沖動性為特征的疾病中所起的作用提供了支持,。另外，本研究證明了內(nèi)表型方法的作用,，而beta節(jié)律的遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)提供了一個潛在的生物學(xué)假設(shè)（即神經(jīng)超興奮性）,，它可以增強(qiáng)我們對功能性大腦回路和AUD以及相關(guān)行為的易感性機(jī)制的理解。

未來研究方向：

1．該研究中的發(fā)現(xiàn)必須在更大樣本量的AA個體中進(jìn)行重復(fù),。未來的研究應(yīng)該考察基因變異對發(fā)育過程中beta節(jié)律軌跡的影響,，以確定特定年齡的影響以及這些影響和/或精神病理開始（AUD、ADHD,、CoD）之間的聯(lián)系,。

2．未來的縱向研究可以探索ADHD、3q26和beta節(jié)律之間的聯(lián)系（例如,，beta節(jié)律可以調(diào)節(jié)3q26和ADHD之間的聯(lián)系嗎,？）

3．隨著beta節(jié)律與嚙齒動物和人類的CoD聯(lián)系在一起,，應(yīng)該進(jìn)一步探索BCHE、beta節(jié)律和CoD之間的明顯聯(lián)系,。

Meyers, J. L., Zhang, J., Wang, J. C., Su, J., Kuo, S. I.,Kapoor, M., ... & Kamarajan, C. (2017). An endophenotype approach to thegenetics of alcohol dependence: a genome wide association study of fast betaEEG in families of African ancestry. Molecularpsychiatry, 22(12),1767.

Doi: https:///10.1038/mp.2016.239