【原】Chem. Sci.：自組裝的兩親性熒光探針用于腫瘤細胞和組織的pH檢測

CBG資訊公眾號 2020-10-05

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一般而言,，癌細胞無法自給自足，通過汲取健康細胞和細胞外基質的各種營養(yǎng),，在厭氧條件下也能生長,，這使得腫瘤微環(huán)境變得不均勻，對腫瘤的治療和診斷產生障礙,。癌細胞中的厭氧糖酵解將葡萄糖代謝為乳酸,，導致癌細胞環(huán)境變成酸性，進而形成酸中毒（沃堡效應）,，這使得免疫系統(tǒng)錯誤地識別癌變的組織和細胞,。此外，酸中毒提供了有利于腫瘤血管生成的環(huán)境,。因此,，檢測細胞器水平的pH差異和波動不失為識別癌癥的有效方式。

基于此,，韓國基礎科學研究所的Kwan Soo Hong,、印度Amrita Vishwa Vidyapeetham大學的Sankarprasad Bhuniya和美國德克薩斯大學奧斯汀分校的JonathanL. Sessler課題組合作設計了一種兩親性長鏈pH熒光探針（CS-1），用于區(qū)分正常細胞與癌細胞,，同時定性監(jiān)測癌細胞和非癌細胞的膜表面以及各種細胞器內的pH波動,，該探針為腫瘤疾病的診斷和研究提供一定基礎,。相關成果以“Self-assembledamphiphilic fluorescent probe: Detecting pH fluctuations within cancer cellsand tumour tissues”為題發(fā)表在Chemical Science上（DOI: 10.1039/D0SC03795H）,。

首先,，作者通過6個連續(xù)步驟合成了探針CS-1。作者以N-(2-溴乙基)鄰苯二甲酰亞胺為原料經過2步反應高收率獲得化合物2,；以A為原料與乙二胺反應得到化合物3,；3與溴乙酸叔丁酯進行N-烷基化反應得到中間體4，4與2反應得到化合物5,；最后,，用三氟乙酸進行脫保護得到長尾兩親性pH探針CS-1（Scheme 1a）。同時,，為了研究標記為N（a’/b’）的氨基中心在pH依賴性熒光響應中的作用,，作者制備了兩種參考物R1和R2。作者猜測探針CS-1可在pH 4.0的條件下進行自組裝且在pH 7.0的條件下解聚（Scheme 1b）,。

（來源：Chemical Science）

為了探究探針CS-1是否可以通過繪制pH波動來區(qū)分癌細胞和正常細胞,，作者用A549（人肺腺癌細胞）、AGS（人胃腺癌細胞）和MRC-5（人正常胚肺成纖維細胞）進行熒光成像研究,。經流式細胞儀分析（Figure 1a和1b）,，作者發(fā)現(xiàn)用CS-1（20 μM）處理細胞，癌細胞A549和AGS的標記水平分別高達90%和82%,，而正常細胞MCR-5僅為20%,，表明探針CS-1能夠基于細胞內外pH值變化將癌細胞和正常細胞區(qū)分，無需特定的腫瘤靶向配體,。此外,，經CS-1處理的細胞的熒光強度隨pH的增加而減弱（Figure 1c和1d），這表明探針CS-1可以作為細胞酸中毒的標志,。

（來源：Chemical Science）

隨后,，作者探究了CS-1的細胞器定位情況隨時間的變化以及不同pH條件下的定位情況。作者用特異性定位質膜的熒光探針與CS-1和細胞共孵育,，獲得了共定位系數(shù)隨時間變化的熒光圖像,，結果表明隨著時間的推移，CS-1與質膜熒光探針的重疊系數(shù)先增大后減小,，且最大時也僅為0.45（Figure 2a和2b）,。除此之外，作者通過改變細胞的pH值（5-8）發(fā)現(xiàn)重疊系數(shù)隨著pH值的增加直線下降（Figure 2c和2d）,。因此,，作者通過標準質膜標記物確定探針CS-1的重疊系數(shù)從而估算血漿pH為6.0-6.8，這與文獻報道的相一致,。

（來源：Chemical Science）

接著,，作者結合溶酶體示蹤劑獲得了人肺腺癌細胞A549細胞中CS-1隨時間和pH變化的熒光圖像。隨著時間的延長（10-30分鐘）,，CS-1與溶酶體示蹤劑的共定位程度逐漸增加,，表明CS-1逐漸從細胞表面遷移至溶酶體（Figure 3a和3b）,。當pH為5時共定位系數(shù)達到最高值，這與溶酶體的pH在4-6范圍的假設一致,。而在正常細胞MRC-5中,，雖然共定位系數(shù)隨著時間的延長而增大，但遠小于A549的結果（Figure 4a和4b）,，且不隨pH的改變而改變（Figure 4c和4d）,。

（來源：Chemical Science）

在癌細胞的線粒體ATP合成過程中，快速的氧化磷酸化水平與酸中毒息息相關,，因此作者猜測探針CS-1可以定位于線粒體中,，從而估計線粒體酸中毒的程度以及線粒體外膜內部或附近的相對質子濃度。作者結合MitoTracker獲得了A549細胞中CS-1隨時間和pH變化的熒光圖像,。在孵育60分鐘后,，探針CS-1大部分位于線粒體中，共定位系數(shù)高達0.87（Figure 5a和5b）,。pH依賴性共定位研究表明,，當pH小于6時，CS-1與MitoTracker的共定位程度相對較高,，當pH為5時共定位系數(shù)高達0.89,，說明癌細胞的線粒體pH值約為5（Figure 5c和5d）。除此之外,，作者發(fā)現(xiàn)當pH為5時,，質膜、溶酶體和線粒體的共定位系數(shù)增加到0.68,、0.84和0.89（Figure 2, 3和5）,，所以CS-1在各種細胞器中的共定位程度也取決于各個細胞器的pH。

（來源：Chemical Science）

最后,，基于CS-1可以標記直徑為300 μm的A549球狀體產生綠色熒光響應（Figure 6a）,，作者在攜帶A549異種移植的Balb/c裸鼠中用CS-1進行腫瘤標記。尾靜脈注射CS-1 24小時后,，作者將小鼠處死并解剖腫瘤,，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織切片產生強烈的熒光，特別是腫瘤邊界區(qū)域,，而肌肉和肝臟區(qū)域幾乎沒有熒光（Figure 6b）,。另外，在腫瘤邊界處觀察到的熒光強度比其他器官增強約8倍（Figure 6c）,。