中性粒細(xì)胞是哺乳動(dòng)物非特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組分，具有消化,、吞噬和殺菌的作用,，其胞漿內(nèi)含有大量中性細(xì)顆粒。這些中性細(xì)顆粒與中性粒細(xì)胞的生理功能與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān),，因而備受研究者的關(guān)注,。然而，到目前為止還沒有特定的熒光活體染色劑來監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)中性粒細(xì)胞顆粒的動(dòng)態(tài),。

日前,，巴黎第五大學(xué)Romain Duval和法國(guó)巴斯德研究所Emma Colucci-Guyon基于監(jiān)測(cè)中性粒細(xì)胞顆粒動(dòng)態(tài)變化這一研究目標(biāo)，設(shè)計(jì)合成了一系列苯并查耳酮熒光探針,，并通過表型篩選確定探針HAB為首例斑馬魚幼體的中性粒細(xì)胞顆粒特異性小分子示蹤劑,，同時(shí)記錄了吞噬作用過程中HAB染色的中性粒細(xì)胞顆粒的動(dòng)態(tài)變化。相關(guān)成果發(fā)表于Chem. Sci.（DOI: 10.1039/c8sc05593a）,。

眾所周知,，有機(jī)熒光團(tuán)通常為推拉電子體系，通過擴(kuò)展共軛體系,，可以使分子具備有效的激發(fā)態(tài)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的能力,。查耳酮本身并無熒光特性，給電子芳環(huán)（B）與烯酮形成共軛結(jié)構(gòu),，芳基羰基（A）在查爾酮結(jié)構(gòu)中作為吸電子基團(tuán),。作者選取3-氨基苯并查耳酮作為最佳熒光團(tuán)以構(gòu)建熒光分子,，并預(yù)期該分子能顯示出最大的熒光強(qiáng)度和紅移效應(yīng)（Figure 1）。

（來源：Chem. Sci.）

作者首先合成了一系列基于查耳酮結(jié)構(gòu)的熒光探針3-8,、12和14（Figure 2A）,。通過對(duì)探針3-8進(jìn)行光學(xué)性質(zhì)分析，作者發(fā)現(xiàn)探針8具有最高的熒光量子產(chǎn)率（Figure 2B）,。探針8與探針12和14相比,，熒光量子產(chǎn)率明顯提高，這是由于萘環(huán)是強(qiáng)給電子基團(tuán),，可以在查耳酮結(jié)構(gòu)中起到修正熒光團(tuán)的作用,，同時(shí)在擴(kuò)展共軛模式時(shí)，羰基具有永久性的烯醇化作用,。因此,，探針8比探針12的熒光更強(qiáng)，且量子產(chǎn)率提高了20倍（Figure 3）,?；谔结?strong style="box-sizing: border-box;padding: 0px;letter-spacing: 1.25px;font-weight: bold;">8良好的光物理性質(zhì)，作者將其命名為HAB并用于后續(xù)的生物測(cè)試,。

（來源：Chem. Sci.）

（來源：Chem. Sci.）

隨后,，作者對(duì)HAB的溶劑效應(yīng)進(jìn)行研究（Figure 4）。HAB及其未取代的類似物6表現(xiàn)出顯著的溶劑化顯色性,，在水,、生物緩沖液和醇中幾乎不發(fā)熒光，在極性非質(zhì)子溶劑（例如乙酸乙酯）中適度發(fā)光,，在非極性溶劑（例如甲苯）中發(fā)強(qiáng)烈的熒光（Figure 4a和4b）,。作者在HAB溶液中加入牛血清白蛋白（BSA），隨著BSA濃度的增加,，熒光光譜發(fā)生紅移,，并且在578 nm處的熒光增強(qiáng)（Figure 4d-f）。作者猜想,，盡管HAB在生物緩沖液中熒光較弱,，但其與生物體系中的靶向蛋白連接后，熒光有明顯的增強(qiáng),。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,，HAB胞質(zhì)溶膠和游離形式的膜等在細(xì)胞室中顯示出較弱或可忽略的熒光，在靶標(biāo)結(jié)合時(shí)顯示較強(qiáng)熒光,。

（來源：Chem. Sci.）

為了驗(yàn)證HAB可以標(biāo)記斑馬魚胚胎及其幼體內(nèi)中性粒細(xì)胞顆粒,，作者進(jìn)行了斑馬魚活體成像實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，受精32 h后的斑馬魚胚胎腹側(cè)尾部區(qū)域有較弱的熒光,，隨著斑馬魚的生長(zhǎng),，熒光逐漸增強(qiáng)，這是因?yàn)榫奘杉?xì)胞以及中性粒細(xì)胞也隨著生長(zhǎng)（Figure 5）,?；谏鲜鰧?shí)驗(yàn)結(jié)果，作者推測(cè)HAB可以標(biāo)記這兩類細(xì)胞,，并且可以隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)在細(xì)胞內(nèi)富集,。

（來源：Chem. Sci.）

作者進(jìn)一步探究了HAB對(duì)中性粒細(xì)胞的標(biāo)記作用。作者構(gòu)建含有熒光蛋白（mCherry蛋白）的轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼體模型,，主要富集在巨噬細(xì)胞的mCherry蛋白顯示紅色熒光,，用HAB處理后,，HAB的綠色熒光并未與mCherry蛋白的紅色熒光重疊,；相比而言，主要富集在中性粒細(xì)胞中mCherry蛋白的紅色熒光與HAB的熒光重疊,，這一結(jié)果說明,，HAB可區(qū)分細(xì)胞類型并主要標(biāo)記中性粒細(xì)胞（Figure 6a-l）。隨后,，作者通過DIC顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)了HAB對(duì)中性粒細(xì)胞顆粒的標(biāo)記作用,，且中性粒細(xì)胞顆粒在細(xì)胞質(zhì)中是不斷運(yùn)動(dòng)的（Figure 6m-p）。

（來源：Chem. Sci.）

接下來,，作者利用HAB對(duì)中性粒細(xì)胞顆粒在吞噬作用中的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究,。作者發(fā)現(xiàn)在酵母多糖的吞噬作用下，HAB標(biāo)記的中性粒細(xì)胞顆粒聚集到含顆粒的吞噬體中（Figure 7）,，這一現(xiàn)象與蘇丹黑B（SB）標(biāo)記的含髓過氧化物酶的中性粒細(xì)胞顆粒的運(yùn)動(dòng)相類似。HAB主要通過可逆的親電抑制作用靶向細(xì)胞內(nèi)的中性粒細(xì)胞絲氨酸蛋白酶,。最后,，作者將HAB用于活體外周血液的染色，發(fā)現(xiàn)HAB對(duì)淋巴細(xì)胞,、單核細(xì)胞,、紅細(xì)胞和血小板的中性粒細(xì)胞具有較好的選擇性（Figure 9）。

（來源：Chem. Sci.）

（來源：Chem. Sci.）

總結(jié)：本文作者設(shè)計(jì)合成了一種基于苯并查耳酮的探針HAB,，并將其應(yīng)用于監(jiān)測(cè)中性粒細(xì)胞顆粒在生物活體中性粒細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化,，為人體相關(guān)生理學(xué)和病理學(xué)的研究提供了一種新的監(jiān)測(cè)方法。