CCK8的原理及優(yōu)勢

生活就是流水賬 2020-07-16

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CCK8是什么

CCK-8的英文全稱是Cell Counting Kit-8，也就是進行細胞計數(shù)的一個盒子,。那它的用途也就大致可以猜到,，和細胞增殖、細胞毒性相關的實驗都可以,。

CCK8的原理

在CCK-8試劑盒中,，最主要的化學藥品是WST-8，化學名為2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽,。它的核心基團和MTT是一樣的,，是MTT的升級版本。在電子耦合試劑（也就是細胞是活的,，有呼吸,，有能量代謝）存在的情況下，可被NAD+氧化還原成為水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物(Formazan),?；罴毎蕉啵a(chǎn)生的Formazan就越多,，顏色也會越深,。
所以粗略的可以認為生成的甲瓚物的顏色的深淺與活細胞的數(shù)量成正比,。為什么是粗略的呢，因為這里沒有考慮到細胞代謝水平的高低,，有些細胞在藥物處理后,，可能活細胞數(shù)不變，但是代謝率低了以后,，細胞呼吸減弱,，NAD+產(chǎn)生減少，測出的Formazan也會減少,。

CCK8的用途

1.細胞增殖測定：細胞增殖實驗在很多領域都會用到,，比如腫瘤相關、損傷后修復等,。
    2.藥物篩選：在測定一個藥物的毒性和安全有效濃度時,，經(jīng)常會用到CCK-8。
    3.細胞毒性測定：這個可以和各個處理因素對細胞活性和增殖的影響,，比如在UV,、低氧或者什么化學物品對細胞的影響上。
    4.腫瘤藥敏試驗：這個是用的比較廣的,，我見過做腫瘤的團隊,，買CCK-8都是一整箱，一整箱的買,。

5.微生物對細胞的毒性或增殖的實驗,。

優(yōu)點：1.酚紅和血清對CCK法的檢測不會造成干擾；

2.細胞毒性非常低,，因此加入WST-8顯色后,，可以在不同時間反復用酶標儀讀數(shù)從而找到最佳測定時間。

CCK法的操作步驟（更多內(nèi)容請見說明書）：

實驗一：細胞活性檢測

1,、在96孔板中接種細胞懸液（100μL/孔）,。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)（37℃,5% CO2）。

2,、向每孔加入10 μL CCK溶液（注意不要在孔中生成氣泡,，它們會影響OD值的讀數(shù)）。

3,、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時,。

4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度,。

5,、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。24小時內(nèi)測定,，吸光度不會發(fā)生變化。

實驗二：細胞增殖-毒性檢測

1,、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時（37℃,，5% CO2）,。

2、向培養(yǎng)板加入10μL不同濃度的待測物質,。

3,、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6、12,、24或48小時）,。

4、向每孔加入10μL CCK溶液（注意不要再孔中生成氣泡,，它們會影響OD值的讀數(shù)）,。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時,。

6,、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

7,、若暫時不測定OD值,，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下,。24小時內(nèi)測定,，吸光度不會發(fā)生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話,，可在加CCK之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基,，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基）,，去掉藥物影響,。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基,，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可,。

計算公式：

o 細胞存活率 = [（實驗孔 — 空白孔）/ （對照孔 — 空白孔）] × 100%

o 抑制率 = [（對照孔 — 實驗孔） / （對照孔 — 空白孔）] × 100%

o 實驗孔（含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8,、待測物質）

o 對照孔（含有細胞的培養(yǎng)基,、CCK-8、沒有待測物質）

o 空白孔（不含細胞和待測物質的培養(yǎng)基,、CCK-8）

保存條件：

4℃避光保存一年有效,，-20℃避光保存兩年有效,。

實驗注意事項

1. 第一次做實驗時，建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入 CCK-8 試劑后的培養(yǎng)時間,。

2. 接種時注意細胞懸液一定要混勻,，以避免細胞沉淀下來，導致每孔中的細胞數(shù)量不一致,。

3. 培養(yǎng)板周圍一圈孔培養(yǎng)液容易揮發(fā),，為減少誤差，建議培養(yǎng)板周圍的四邊每孔只加培養(yǎng)基,。