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Beyond PD-L1 Markers for Lung Cancer Immunotherapy 針對肺癌免疫治療探究PD-L1之外的生物標志物 簡介： 使用免疫檢查點抑制劑進行免疫治療已成為非小細胞肺癌(NSCLC)患者一線和二線的標準治療方法,。然而,，目前還沒有適合的生物因子可以準確地預測免疫治療是否對非小細胞肺癌(NSCLC)患者有效。在前瞻性的臨床實驗,，腫瘤細胞PD-L1的表達水平以及腫瘤突變負荷被用來作為患者使用pembrolizumab(帕姆單抗)和atezolizumab(阿特珠單抗)結合ipilimumab(易普利姆瑪)這兩種免疫治療方法來治療腫瘤的標準,。然而，并非所有具有這些預測因子的患者都能從免疫治療中獲益,。預測免疫治療有效性的困難主要存在于生物因子的檢測和對檢測結果的解釋,。因此，需要尋找其他的預測因素。目前,，對非小細胞肺癌患者腫瘤免疫表型和腸道微生物的識別研究正在深入進行,。免疫治療的有效性與腫瘤中炎癥反應的強度、微生物組的多樣性以及腸道中某些細菌種類的出現(xiàn)之間的相關性已有被相關提及到,。本文的目的是引起人們注意影響NSCLC患者抗PD-L1免疫療法療效的因素,。 除了PD-L1，我們還需要其他標記,，例如TMB（腫瘤突變負擔）或微生物,，才能更準確地確定哪些患者將從免疫治療中受益,。 1,、 免疫治療在非小細胞肺癌(NSCLC)中的應用 免疫治療為非小細胞肺癌(NSCLC)患者提供更多的治療機會。免疫治療的主要原理是阻斷淋巴細胞上的PD-1(程序性死亡1)和腫瘤細胞上的PD-L1(程序性死亡配體1)的結合,，或者激活浸潤的免疫細胞,，進而激活T細胞消滅腫瘤。目前,，在歐盟和美國注冊了四種用于治療非小細胞肺癌患者的免疫療法,。這些免疫療法會用到以下抗體：Nivolumab (抗PD-1單抗)，Pembrolizumab (抗PD-1單抗),，Atezolizumab (抗PD-L1單抗), Durvalumab(抗PD-L1單抗),。盡管免疫療法在某些患者中可以有效地治療非小細胞肺癌，并提供持久的緩解,，但由于過度刺激免疫系統(tǒng),，使其對患者產生嚴重的副作用?？筆D-1或抗PD-L1單克隆抗體的毒性通常比化學療法低,。然而，它們可以引起輕微或嚴重的毒性來影響內分泌器官或大腸和支氣管的粘膜,。免疫治療的嚴重副作用包括與免疫相關的結腸炎,、肝炎、腸道肺炎,、甲狀腺炎,、垂體炎等。因此根據通用毒性標準（CTC）,，特定階段的毒性需要采取適當的程序,，如果免疫治療產生的毒性大于一定程度，則會停止免疫治療,。此外,，免疫療法可能會在4％至30％的患者中加速腫瘤的進展。目前對于使用免疫治療的腫瘤患者來說，還有很多無法解釋的現(xiàn)象,，例如現(xiàn)有的預測因子無法準確的預測腫瘤患者是否適合使用免疫療法,。在NSCLC患者中使用抗PD-1和抗PD-L1抗體進行免疫治療指征和預測因素非常多樣。PD-L1和TMB的表達并不是免疫療法完美的預測指標,。 2,、 免疫檢查點理論 目前，使用免疫檢查點抑制劑的免疫療法是癌癥治療的新突破,，免疫檢查點抑制劑主要針對CTLA-4和PD-1,。 2.1 CTLA-4 T淋巴細胞激活和細胞應答通過抗原呈遞細胞（APC）和T細胞之間的復雜相互作用而發(fā)生。用T細胞受體（TCR）識別MHC（主要組織相容性復合物）分子上的抗原尚不足以產生免疫應答,。第二信號由APC上的B7家族成員提供,。T細胞上的CD28與抗原呈遞細胞上的B7.1（CD80）或B7.2（CD86）結合，是T細胞活化的主要共刺激信號,。CTLA-4（細胞毒性T淋巴細胞抗原4）與CD28是同源物質,，其能與B7.1（CD80）或B7.2（CD86）結合，但CTLA-4與CD-28作用相反,，其傳遞抑制信號給T細胞,，進而減弱T細胞活化。 2.2 PD-1和PD-L1 PD-1位于T淋巴細胞,，NK細胞和非刺激性B淋巴細胞上,，即參與特定免疫反應的細胞。樹突狀細胞,，巨噬細胞和單核細胞在干擾素等因子刺激后可能會表達出PD-1,。另外，PD-1的表達還可以通過其他促炎性細胞因子誘導細胞毒性和輔助性T淋巴細胞中PD-1 mRNA的轉錄而得到增強,。當PD-1和其配體PD-L1相互結合時,，會給T細胞傳遞抑制信號，抑制T細胞活化,。 PD-L1分子是一種跨膜糖蛋白,，主要存在于先天細胞（巨噬細胞或單核細胞）的表面。在健康人群中,，這些細胞可能會表現(xiàn)出PD-L1分子的負表達,，而在持續(xù)的慢性炎癥過程中，這種分子的表達會被誘導,，這是一種防止T淋巴細胞過度活化的機制(PD-L1與PD-1的相互作用會抑制PD-1陽性細胞的活性),。 2.3免疫檢查點用于腫瘤治療 然而，PD-L1的表達也可能存在于腫瘤細胞中,，這一機制使得腫瘤細胞能夠從免疫系統(tǒng)中逃逸,。如今,，使用免疫檢查點抑制劑進行免疫療法的基本思路是防止PD-1和PD-L1或CTLA-4和B7.1 / B7.2相互作用后導致T細胞內抑制信號的傳遞。因此,，使用阻斷PD-1或PD-L1分子的單克隆抗體治療腫瘤成為科學家關注的對象,原理見（Figure 1）,。 目前臨床上非小細胞肺癌(NSCLC)患者主要采取化療的方法進行救治,，患者在一線治療中達到了50%的疾病控制,，在二線治療中達到了20-25%，反應持續(xù)時間較短,，總體生存期約為12個月,。而免疫檢查點治療可以提高患者的總體生存率。研究表示在二線治療中使用PD-1/PD-L1檢查點抑制劑NSCLC患者二線治療中獲得更高的生存率和更好的安全性,。在一線治療中,，根據PD-L1的表達水平制定不同的免疫治療方案，有助于提高患者的生存率,。在前瞻性的臨床實驗,，腫瘤細胞PD-L1的表達量被認為是判斷免疫治療是否有效的預測因子,。然而，關于PD-L1在免疫治療中的作用,，科學家還存在分歧,。由于不同的PD-L1在腫瘤細胞和免疫細胞表達的隨機化的不同，會對免疫治療方案產生影響,。如,，在二線治療中，pembrolizumab用于任何PD-L1表達的患者,，nivolumab和atezolizumab用于腫瘤細胞上有PD-L1表達或無PD-L1表達的患者,。有研究表明，PD-L1表達作為免疫治療的預測因子的臨床試驗的不同結果可能是由于免疫組化(IHC)檢測和評估PD-L1表達的方法存在顯著差異,。因此,，PD-L1在腫瘤或免疫細胞上的表達并不是免疫治療的理想預測因子。臨床試驗表明,，使用抗PD-1或抗PD-L1抗體進行二線治療,，即使在腫瘤或免疫細胞上沒有表達PD-L1的患者，也可能有效,，并且,，許多腫瘤或免疫細胞上表達PD-L1的患者對免疫治療缺乏反應。因此,，有必要尋找新的預測因子來判斷非小細胞肺癌(NSCLC)患者是否適用免疫療法,。高腫瘤突變負荷被科學家認為很有可能成為免疫治療的重要預測因子，并且在已有臨床實驗在進行測試,。TMB是對腫瘤基因組每個編碼區(qū)域的體細胞非同義突變總數的定量測量,。在免疫檢查點抑制(ICI)治療下，TMB可能會轉化為更高的新抗原負荷和產生更多更有效的抗原,，進而使得腫瘤細胞與細胞毒性T細胞發(fā)生相互作用,。多項臨床試驗和亞分析解決了TMB在ICIs治療的NSCLC患者中作為預測標志物的潛在作用的問題。在Rizvi等人的一項回顧性研究中,，對34名接受pembrolizumab（派姆單抗）治療的晚期NSCLC患者進行了研究,，結果表明，高TMB（≥178非同義突變de?ned by WES）與更好,，更持久的客觀反應以及PFS(無進展生存期)獲益有關,。Peters等科學家研究表明不管PD-L1的表達水平如何，TMB都能夠成為非小細胞肺癌(NSCLC)患者免疫檢測點抑制(ICI)治療的預測因子,，TMB能夠識別在PD-L1低表達或陰性表達亞組中nivolumab + ipilimumab或durvalumab + tremelimumab將受益的患者,。然而，TMB有重要的局限性,，如測試的周轉時間長,，需要大量腫瘤細胞進行測試，不同研究的陽性結果的閾值不清楚,，但有限的數據證明TMB對ICI聯(lián)合治療的患者的OS（總生存期）具有預測性,。雖然，目前TMB和PD-L1是判斷NSCLC患者能否從免疫治療獲益的最可靠生物標志物,。然而TMB和PD-L1作為預測因子,，存在診斷問題，這可能會導致無法準確判斷患者是否能夠使用免疫治療,，進而導致較差的臨床效果,，因此，需要考慮其它的預測因子,。與腫瘤免疫細胞滲透相關的基因組特征以及免疫原性分析可能對分析ICI治療后的治療選擇和患者預后具有潛在作用,。在許多臨床試驗中，人們不僅要對癌癥組織進行病理和分子診斷,，而且要對負責抗腫瘤免疫反應的免疫細胞進行分析,。評估免疫系統(tǒng)活動參數的方法既可以預測疾病的進程，也可以規(guī)劃有效的免疫治療類型,，以增加免疫系統(tǒng)功能或調節(jié)免疫系統(tǒng)功能,。Table2展示應納入免疫分析的基本測試。通過對腫瘤組織的免疫學檢查,，可以明確腫瘤的三種基本免疫特性,，這三種免疫特性與抗PD-1和抗PD-L1抗體相關,。1）免疫炎癥表型，即所謂的“熱腫瘤”,，其特點是存在CD8陽性的細胞毒性T淋巴細胞以及CD4陽性的記憶和調節(jié)性T淋巴細胞,。此外，淋巴細胞滲透常伴有非特異性反應細胞的存在,。免疫細胞在腫瘤組織中產生許多促炎細胞因子和效應細胞因子的能力也可以通過mRNA分析來檢測,。在這類腫瘤中觀察到不理想的或衰竭的抗腫瘤免疫，因此治療的目的是增強現(xiàn)有的免疫反應,。2）免疫排斥表型,，其特征是免疫細胞侵入腫瘤的能力不足。免疫細胞不會滲透腫瘤核心,，而是保留在基質中,。科學家認為這是由強抑制腫瘤微環(huán)境產生的吲哚2,3-雙加氧酶(indole 2,3-dioxygenase, IDO)或IL-10等免疫抑制代謝產物引起,，進而阻斷了免疫細胞的活性,。因此，治療目的是逆轉腫瘤的免疫抑制作用,，并導致預先存在的抗腫瘤反應滲透到基質中,。3）免疫沙漠表型，即所謂的“冷腫瘤”,，其特征是腫瘤核心或基質中缺乏T細胞,。在腫瘤微環(huán)境中，腫瘤或趨化因子不釋放免疫抑制因子,。這種表型可能考慮到先前存在的抗腫瘤免疫的缺失。因此,，針對這類腫瘤組織的治療目標集中于啟動新的免疫應答,。這種三分法在大多數實體腫瘤中都可以觀察到，它與癌癥對免疫檢查點抑制劑治療的反應有關,。最高的免疫反應率與腫瘤組織的炎癥表型有關,，但確切的作用機制更為復雜。首先,，高濃度的促炎性細胞因子（IFN-γ）刺激PD-L1在腫瘤細胞以及非淋巴細胞上的表達,。這增加了對PD-1陽性淋巴細胞的抑制，成為抗PD-1和抗PD-L1抗體的目標,。此外,，ICI治療后，現(xiàn)有但受阻的免疫反應得到加強,。相反的情況發(fā)生在“冷腫瘤”中,，那里沒有炎癥細胞或淋巴細胞,，在這種特殊情況下，使用ICI治療將沒有一個合理的解釋,。然而,，PD-L1表達與炎癥表型并沒有嚴格的相關性?！袄淠[瘤”也可以表達PD-L1,。眾所周知，PD-L1在腫瘤細胞上的高表達與抗PD-1或抗PD-L1免疫治療后的重要臨床反應有關,。但是證據表明,，某些PD-L1陰性患者也可能對免疫療法產生反應。 在許多動物模型的研究中,，PD-L1分子的存在不僅對腫瘤細胞有重要意義,，更重要的是對宿主免疫細胞有重要意義。Tang等發(fā)現(xiàn),，無論PD-L1在腫瘤細胞上的表達狀態(tài)如何,，抗PD-L1抗體都會在腫瘤組織中積累。PD-L1具有對抗原提呈細胞的負性調節(jié)和抑制T細胞的功能,。最后,，腫瘤內部的PD-L1阻斷不足以激活T細胞活性，因為T細胞進入腫瘤的轉運受損,。Lin H等研究發(fā)現(xiàn),，在PD-L1或PD-1陰性或免疫缺陷小鼠中，即使在PD-L1過表達的腫瘤中,，PD-L1阻斷也沒有效果,。這些研究結果表明，PD-L1在宿主免疫細胞上表達,，而不是在腫瘤細胞上,，在檢查點阻斷治療的療效中起著至關重要的作用。綜上所述,，預測治療結果或明確病人的選擇不僅應該基于PD-L1的表達,，還應該基于各種炎癥跡象。不同的基因標記(腫瘤炎癥標記)被用來解釋癌癥對ICIs的反應或耐藥機制,。似乎一種更簡單的分析,，可以在任何腫瘤科進行，所謂的肺免疫預后指數(LIPI),。LIPI結合了治療前產生的外周血中性粒細胞與淋巴細胞比率(dNLR)和乳酸脫氫酶(LDH)水平,，Varga等人進行了相關研究。作者認為,，這種經過精確計算的免疫治療方法可以將患者分為不同的群體,，這些群體將從免疫檢查點抑制劑治療中受益,。然而，不能排除LIPI主要是一個預后因素,，而不是一個預測因素,。人腸道微生物組在門分類水平上具有相當穩(wěn)定的組成。革蘭氏陰性細菌是人類胃腸道（GIT）生理微生物組中數量最多的細菌,。腸道微生物多樣性高,，促進巨噬細胞和淋巴細胞分化，促進細胞毒性T細胞活化,，上調PD-1在淋巴細胞上的表達,。腫瘤患者的微生物組不僅可以在胃腸道（GIT）中檢測，還可以在腫瘤和鄰近組織中檢測（Figure2）肺組織微生物組形成一個獨特的集群,，大部分與腸道,、皮膚、陰道或口腔和鼻腔的微生物組分離,。變形桿菌門是在非惡性肺組織手術切除的NSCLC患者中占主導地位的一門(60%),。厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門在非惡性肺組織中占少數,。微生物群落多樣性隨環(huán)境暴露(空氣污染和人口密度)和吸煙強度的增加而增加,。非腫瘤肺組織中細菌種類的數量和多樣性明顯高于腫瘤組織和慢性支氣管炎上皮細胞。重度吸煙者肺微生物組組成(失調)和上皮細胞解體的紊亂可能是慢性阻塞性肺疾病和肺疾病炎癥過程的主要原因,。有證據表明,，反復接觸抗生素和由此導致的失調也會增加肺癌的風險。如今,，微生物組已作為致病性（破壞細菌代謝產物的DNA）或免疫刺激劑在癌癥患者中進行了廣泛研究,。有機體免疫力取決于腸道微生物組的組成。似乎癌癥患者的腸道微生物群可以影響患者對免疫檢查點抑制劑免疫治療的反應,。腸道菌群失調可能是引起ICIs耐藥的主要原因,。已經證明，抗生素限制了ICI對晚期癌癥患者的療效,。抗生素降低腸道菌群多樣性,，導致腸道菌群失調,，影響ICIs的有效性。第一次,，在黑色素瘤患者中觀察到腸道微生物組中特定細菌種類的出現(xiàn)與抗CTLA-4或抗PD-1 / PD-L1抗體的功效之間的關系,。Vetizou等人發(fā)現(xiàn)，經過抗生素治療或無菌處理的小鼠體內的腫瘤對CTLA-4阻斷劑沒有反應,。采用脆弱擬桿菌多糖免疫接種克服了上述作用,，并對脆弱擬桿菌特異性T細胞進行了過繼轉導,。從人類到小鼠的糞便微生物群移植(FMT)證實，用ipilimumab治療黑色素瘤患者有利于的脆弱型芽孢桿菌的生長,，具有抗癌特性,。Botticelli等人研究了用nivolumab治療的NSCLC患者和健康人的腸道微生物組。這項研究表明,，腸道微生物組的原始組成可能會影響對免疫治療的反應,，但是免疫治療也會影響腸道微生物組的組成。PD-L1在腫瘤細胞上的表達和TMB是唯一用于非小細胞肺癌患者接受一線免疫治療的分子預測因素,。但是，對于一線化療和免疫療法聯(lián)合治療以及二線抗PD-1或抗PD-L1抗體單一治療的資格鑒定,，不需要任何分子預測因素,。事實上，在腫瘤細胞上沒有PD-L1表達或TMB較低的患者中,，免疫治療的效果是可以觀察到的,。此外，有時即使有治療傾向,，ICI治療也沒有反應,。PD-L1表達評估和TMB檢測的方法還沒有明確的定義，因此有必要尋找新的預測因素進行治療,。炎性細胞的存在會影響腫瘤的形成和淋巴細胞產生促炎性因子的能力,，可能會提高免疫療法的有效性。此外,，腫瘤的免疫表型可能表明有必要使用不同的免疫治療方法組合,。最后，微生物組的多樣性和某些細菌種類的存在可以提高免疫療法的效力,。 患有失調癥的癌癥患者（例如,，經過抗生素治療后）的微生物組重建可能會使他們對免疫治療敏感。以上所有這些都說明了強大的個性化診斷和治療方法的必要性,，包括對PD-L1,，TMB和微生物組分析的全面評估。這種方法可對患者實施最有效的治療方并且對患者的副作用相對較低,。
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